杜仲总黄酮对铅中毒小鼠学习记忆能力的影响*

刘梦姣，袁带秀 ，聂　红，黄　莲，李翠琴

(吉首大学医学院，湖南　吉首　416000)



杜仲总黄酮对铅中毒小鼠学习记忆能力的影响*

刘梦姣，袁带秀 ，聂红，黄莲，李翠琴

(吉首大学医学院，湖南吉首416000)

研究了杜仲总黄酮对铅中毒小鼠学习记忆障碍的改善作用，并探讨其可能的作用机制。建立铅中毒模型，用小鼠跳台实验检测小鼠学习记忆能力；检测脾脏和胸腺指数；生物化学法检测脑组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)、总体抗氧化酶(T-AOC)的活力和丙二醛(MDA)的含量。结果表明：杜仲总黄酮能改善铅中毒小鼠的学习记忆能力；提高铅中毒小鼠的脾脏和胸腺指数；提高脑组织中T-SOD、GSH-Px、T-AOC活力和降低MDA的含量。杜仲总黄酮对铅中毒小鼠学习记忆障碍有明显的改善作用，其作用机制可能与杜仲总黄酮能提高机体的免疫能力和抗氧化能力有关。

杜仲总黄酮；铅中毒；学习记忆；脏器指数；抗氧化

铅是广泛存在于自然界中的一种有毒重金属，其在神经系统蓄积后，可干扰脑细胞活动，破坏神经元结构，影响神经系统的多种功能，特别是学习记忆功能[1]。铅暴露能使细胞活性氧增加，破坏机体氧化/抗氧化动态平衡，改变抗氧化酶活性及脂质过氧化水平，从而导致细胞氧化损伤[2]。

杜仲又名木棉、思仙、思仲、思锦树，为单科单属落叶桥木，是第三世纪冰川运动遗留下来的“活化石”。杜仲中所含的化学成分按其结构可分为木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、萜类、多糖类等。现代药理学研究表明，黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性，主要机理包括：一是作为自由基链式反应阻断剂，二是作为金属离子螯合剂[3]。而有关杜仲总黄酮对铅中毒所导致的小鼠学习记忆障碍有否改善作用，目前还未见报道。本实验采用铅染毒模型，观察杜仲总黄酮对铅所致学习记忆损坏的改善作用，并对其作用机制进行初步探讨，为临床应用杜仲总黄酮防治铅中毒提供实验依据。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

杜仲总黄酮(含黄酮83.61%)自制，临用时用生理盐水溶解；依地酸钙钠注射液，天津金耀药业有限公司生产；醋酸铅(分析纯)，天津博迪化工股份有限公司。

总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)、总体抗氧化酶(T-AOC)、丙二醛(MDA)、蛋白质定量测定试剂盒，南京建成生物工程公司。

1.2主要仪器

SDT-8M型跳台实验视频分析系统，成都泰盟科技有限公司；迈瑞BC-300全自动生化分析仪，武汉市百瑞医疗器械有限公司；TD5A台式低速离心机，湖南凯达。

1.3动物分组与给药

健康的昆明种小鼠50只，雄性，体重18～22 g，清洁级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组；铅染毒组(模型组)；CaEDTA组(阳性对照组)；杜仲总黄酮治疗组(高、低剂量分别为200、50 mg/kg)。模型制备：模型组、阳性对照组和杜仲总黄酮治疗组每天腹腔注射70 mg/kg的Pb(AC)2溶液(10 mL/kg)，连续给药8 d，复制铅中毒模型；空白对照组每天腹腔注射等量的生理盐水。模型复制完成后恢复3 d给药：杜仲总黄酮治疗组腹腔注射相应剂量的杜仲总黄酮(10 mL/kg)；空白对照组与模型组腹腔注射10 mL/kg的生理盐水；每天1次，连续给药14 d；阳性对照组腹腔注80 mg/kg CaEDTA溶液(10 mL/kg)，每天1次，连续给药10 d，第11 d开始每天腹腔注射等量的生理盐水，连续给药4 d。

1.4小鼠跳台实验

实验结束后1 h，对小鼠进行跳台训练，通过小鼠跳台实验检测小鼠学习记忆功能。实验时，将小鼠放在铜栅栏上，当铜栅通电时，小鼠受到电击而跳上平台。如此训练5 min，并记录每只鼠受到电击的次数(错误次数)，以此为学习成绩。24 h后重新测验，此次测验时，先将鼠放在跳台上，记录第一次跳下的时间(潜伏期)，受电击5 min内的错误次数，以此反映记忆保持情况。动物每隔1天测试1次，每次5 min，共3次，记录最后1次小鼠的潜伏期和错误次数。

1.5小鼠免疫器官脏器指数检测

跳台实验测试完后，将小鼠颈椎拉断处死，摘取完整胸腺，并分离脾脏，去掉筋膜及脂肪组织，称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，再乘以10，得到胸腺指数和脾脏指数。计算公式如下：

胸腺指数或脾脏指数=( 胸腺或脾脏重量/小鼠体重)×10

1.6小鼠脑组织T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量的测定

小鼠颈椎拉断处死后，迅速取出脑组织，以冰浴冷却生理盐水漂洗，除去血液，用滤纸擦干，取组织块0.4 g，置于组织匀浆器中，加入冰浴冷却的生理盐水3.6 mL研磨成10%的组织匀浆液，迅速放入冷冻离心机，3000 r/min离心15 min，取上清液，依据试剂盒说明书，检测脑组织T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量。

1.7统计学处理

数据以±S表示，利用SPSS16.0统计软件，单因素方差分析，组间比较采用q比较。

2　实验结果

2.1小鼠跳台实验结果

杜仲总黄酮对铅染毒小鼠跳台潜伏期和错误次数的影响见表1。由表1可知，连续8d腹腔注射70 mg/kg醋酸铅，可以导致小鼠学习记忆障碍，模型组与空白对照组相比较，小鼠在平台上停留直至铜栅上的潜伏期缩短，差异极显著(P<0.01)，错误次数增加，但差异不显著(P>0.05)；杜仲总黄酮治疗组(200、50 mg/kg)可对抗铅染毒所致小鼠记忆障碍，各治疗组均可使小鼠在平台上停留直至铜栅上的潜伏期延长，与模型组相比差异具有显著性(P<0.01)，而错误次数具有减少的趋势。

组别剂量/(mg·kg-1)潜伏期/s错误次数空白对照组294.8±4.15b0.6±0.24模型组7032.40±6.94a3.2±1.93阳性对照组80282.4±8.95b0.8±0.2杜仲总黄酮治疗组200185.8±1.82ab1.4±0.2450106.4±7.24ab1.60±0.4

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

2.2杜仲总黄酮对铅染毒小鼠免疫器官脏器指数的影响

与空白对照组比较，铅染毒组即模型组脾脏、胸腺指数均降低，呈显著性差异，说明铅染毒模型组小鼠免疫功能低下。与铅染毒模型组相比，杜仲总黄酮各治疗组脾脏、胸腺指数均升高，且差异显著。结果见表2。

表2　杜仲总黄酮对铅染毒小鼠免疫器官指数的影响

注：与空白对照组比较，aP<0.01，cP<0.05；与模型组比较，bP<0.01。

2.3杜仲总黄酮对铅染毒小鼠脑T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量的影响

结果显示，连续腹腔注射70 mg/kg醋酸铅8 d，可以导致小鼠脑组织内T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性降低，而MDA含量增加；连续腹腔注射杜仲总黄酮治疗14 d后，与模型组相比，杜仲总黄酮各治疗组可升高T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性，降低MDA含量(P<0.01)。见表3。

表3　杜仲总黄酮对铅染毒小鼠脑T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA含量的影响

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

3　讨　论

铅是一种神经系统发育的有害物，它对神经细胞的正常发育以及神经递质的正常分泌产生影响和损害，因而进一步影响学习和记忆能力。从小鼠跳台实验结果中可知，小鼠经过连续8 d腹腔注射70 mg/kg醋酸铅，使得模型组的潜伏期缩短，错误次数增加，学习记忆能力发生障碍，这与任振华等[1]的实验结果一致，表明建模成功。当通过杜仲总黄酮治疗后，小鼠的潜伏期延长，错误次数减少，学习记忆能力提高。由此说明，适当剂量的杜仲总黄酮可以改善实验性铅中毒小鼠的学习记忆能力。

免疫器官的脏器指数是衡量机体免疫功能的初步指标。脾脏和胸腺是机体主要的免疫器官，其脏器指数的高低能较为客观地反映机体非特异性免疫能力。本试验通过连续给小鼠8 d腹腔注射70 mg/kg醋酸铅，造成铅中毒，发现小鼠的脾脏和胸腺指数均下降；经过14 d的杜仲总黄酮治疗后，各治疗组的脾脏和胸腺指数均明显升高。表明杜仲总黄酮对动物免疫功能的增强作用可通过增加免疫器官质量来体现。

SOD是机体直接清除自由基的抗氧化酶，可以分解过氧化氢和脂质过氧化物，阻断脂质过氧化反应，保护细胞免受损伤[4]。模型组小鼠中的铅降低了质膜对自由基的防御能力，消弱了细胞的抗氧化防御能力，导致了SOD活性降低[5]。有实验证实杜仲总黄酮可以提高血清的SOD活性[6]，所以经过杜仲总黄酮治疗后，可能通过减轻脂质过氧化反应达到抗氧化作用，直接或间接清除了铅引起的自由基对脑组织造成的损伤，进而学习记忆能力得到一定程度的恢复。GSH-Px是H2O2防御系统成员，可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤的过程中起着关键作用[7]。T-AOC代表体内酶类和非酶类抗氧化物质的总和，是反映机体抗氧化能力的重要指标，其强弱与健康状况和疾病状态之间存在着密切的联系，当其降低时，会引起炎性反应、肿瘤和免疫系统疾病等[8]。MDA是不饱和脂肪酸过氧化产物之一，其含量的高低常常反映机体组织内脂质过氧化的程度。生物膜中的不饱和脂肪酸易被自由基攻击而发生过氧化，导致细胞结构和功能的变化，使得细胞的抗氧化能力下降。本试验研究发现连续8 d腹腔注射70 mg/kg醋酸铅，可使小鼠脑组织内MDA含量显著升高，GSH-Px、T-AOC活力显著降低，而经过杜仲总黄酮治疗14 d后，小鼠脑组织内MDA含量明显降低，GSH-Px、T-AOC活力明显升高，表明铅可能通过损伤抗氧化系统发挥毒性作用，杜仲总黄酮则通过提高动物体内各种脂质过氧化物酶的活性，达到解除铅对抗氧化系统损伤的作用，从而达到拮抗铅毒性作用。

总之，试验进一步证实了铅可以降低小鼠的学习记忆能力，同时发现了杜仲总黄酮对铅导致的学习记忆障碍有一定的改善作用，其机制可能与杜仲总黄酮能提高机体的免疫能力和和抗氧化能力有关。

[1]任振华,李光武.铅对小鼠学习记忆及自主活动的影响[J].环境与健康杂志，2006，23(3):237.

[2]刘会芳,韩璇,郝俊生,等.川芎嗪注射液对铅中毒小鼠学习记忆功能及抗氧化能力的影响[J].时珍国医国药，2013,24(2):328-329.

[3]夏道宗,金相国,陆超,等.高良姜总黄酮对铅中毒致小鼠脑、肾氧化应激的保护作用研究[J].浙江中医药大学学报，2013,37(8):1018-1021.

[4]方中允.自由基生物学的理论与应用[M].北京：科学出版社，2002:133.

[5]Flerov MA，Shalyapina VG.Free-radical lipid oxidation in the brains of active and passive Rats during the development of post-stress depression[J].Neurosci Behau Physiol，2009,39(5):471-474.

[6]袁带秀,舒丽霞,黄荣.杜仲总黄酮对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用[J].中国临床药理学与治疗学，2014,19(12):1332-1335.

[7]帅学宏,胡庭俊,陈炅然,等.鬼臼多糖对小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响[J].畜牧兽医学报，2008，39(7):1000-1004.

[8]易金娥,屠迪,邬静,等.桦木酸对小鼠免疫器官抗氧化能力的影响[J].动物营养学报，2012,24(4):786-789.

Effects of Total Flavonoids of Eucommia Ulmoides on Learning Memory Impairment Induced by Lead in Mice*

LIU Meng-jiao， YUAN Dai-xiu， NIE Hong， HUANG Lian， LI Cui-qin

(College of Medicine, Jishou University, Hunan Jishou 416000, China)

The effects of total flavonoids of Eucommia ulmoides on memory impairment in mice induced by lead acetate were investigated and its possible mechanisms were discussed. Mouse model of lead poisoning was established, the learning and memory ability was evaluated by jumping platform experiment, spleen and thymus index were detected, besides the content of T-SOD, GSH-Px, T-AOC and MDA in brain tissue was assayed. Results showed that the total flavonoids of Eucommia ulmoides could improve the learning memory ability and viscera index in mice induced by lead acetate, and it could also increase the activities of T-SOD, GSH-Px, T-AOC and reduce the content of MDA of mouse brain. The total flavonoids of Eucommia ulmoides had the function of improving learning and memory impairment obviously in mice induced by lead acetate. The effects may be due to increasing the immune function and anti-oxydation of lead poisoning mice.

total flavonoids of Eucommia ulmoides; lead poison; learning and memory; viscera index; anti-oxydation

吉首大学大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2015)；2015年医学类专业大学生创新训练项目(JDYXCX201514)；2015年吉首大学校级科研项目(15JDX016)。

刘梦姣(1996-)，女，14级临床本科生。

袁带秀(1975-)，女，高级实验师，主要从事民族药物药理活性研究。

R285

A

1001-9677(2016)01-0075-03