湘西土家药羊蹄甲醇提取物体外抗氧化研究*

王春元,李　新,朱　茜,谭武兵,罗艳红,何　玲

(吉首大学医学院，湖南　吉首　416000)



湘西土家药羊蹄甲醇提取物体外抗氧化研究*

王春元,李新,朱茜,谭武兵,罗艳红,何玲

(吉首大学医学院，湖南吉首416000)

用醇提取湘西土家药羊蹄甲活性成份并测定其体外抗氧化活性。采用DPPH法、LPO抑制法和超氧阴离子自由基清除法分别测定羊蹄甲醇提取物体外抗氧化活性。 结果表明：黄酮类提取物可有效地清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基。羊蹄甲醇提取物具有较强的体外抗氧化作用，其有效成分值得进一步开发研究，并为以后的抗氧化研究提供参考依据。

土家药；羊蹄甲；抗氧化

羊蹄甲是土家医学名贵草药，在《中华本草》一书中称为双肾藤，别名有夜关门、截叶铁扫帚、马蹄、羊蹄藤、猪腰藤、马鞍藤、鹰爪风。湘西土家族地区地处武陵山片区，药物资源丰富，其中土家药材羊蹄甲含多种药用功效，具有补肝肾、益肺阴、散瘀消肿的作用，功能主治收敛固涩、解毒除湿、咳嗽、吐血、便血、遗尿、尿频、白带、子宫脱垂、痢疾、痹痛、疝气、睾丸肿痛、湿疹、疮疖肿痛等[1]。黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，它能清除生物体内的自由基, 具有抗氧化作用[2]。研究发现，从植物体中分离出来的黄酮类化合物有多种药理作用：抗脑缺血、抗自由基、抗肿瘤、镇痛、预防心脑血管疾病[3]。

查阅相关文献发现，目前对羊蹄甲在本草学方面有所研究，但对湘西土家族特色药物羊蹄甲其抗氧化性功能仍缺乏深入研究。故本实验以湘西土家药材羊蹄甲为研究对象，采用传统技术和现代技术相结合的方法提取纯化羊蹄甲抗氧化成份，采用DPPH法、LPO抑制法和超氧阴离子自由基清除法分别测定羊蹄甲醇提取物体外抗氧化活性，并对羊蹄甲黄酮成分在体外抗氧化作用进行了初步研究，最终整理数据并用数学统计法进行数据统计，得出羊蹄甲体外抗氧化性活性，为今后羊蹄甲中药抗氧化成份的开发利用提供有价值的参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

羊蹄甲(采自湘西武陵山片区)，60 ℃干燥后粉碎备用。

HPD-500型极性大孔树脂；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、甲醇、无水乙醇、Tris-HCl、邻苯三酚等试剂均为国产分析纯。

1.2仪器

723型可见分光光度计(SP-723)；电子天平(AUY120)；干燥箱(HH.GF-1)；恒温水浴锅(SHH.W21)；KQ-250DE型数控超声波清洗器；旋转蒸发器(RE-52)；移液器；玻璃棒；烧杯；研钵；刻度试管；移液管；橡胶手套。

1.3实验方法

1.3.1羊蹄甲黄酮的提取纯化

准确称取样品20.0 g 三份并放入锥形瓶中，以固液比 1:20加入 70%的乙醇溶液, 于KQ-250DE型数控超声波清洗器中1 h,超声功率为200 W，提取温度为70 ℃， 趁热用 3 层纱布过滤, 滤渣用同样方法进行 2 次提取, 过滤, 合并3次抽滤所得滤液，并定容至200 mL容量瓶, 得到待测提取液，放入冰箱备用。将待测提取液于旋转蒸发器(RE-52)中去除酒精，用已预处理好的大孔树脂吸附1 h，分离出的大孔树脂以70%乙醇洗脱至近无色，此过程重复操作三次，得到纯化的黄酮提取液。

1.3.2对羟自由基(·OH)清除能力的测定

根据文献[5]方法，准确配制一系列质量浓度梯度(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L)的待测溶液，取若干只试管编号，每只试管各加9 mmol/L FeSO4,9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL，最后加入12 mmol/L H2O22 mL启动反应，于37 ℃反应30 min,以去离子水调零，在波长510 nm处测定样品吸光度A1；以去离子水代替双氧水重复上述操作，测得实验本身的分光光度值A2;同样，以水代替黄酮，测定分光光度值A0，按公式(1)计算各质量浓度对羟自由基的清除率。维生素E为对照。

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

式中：A0——自由基发生系统的吸光度

A1——待测吸光度值

A2——对照吸光度值

1.3.3对DPPH自由基清除能力的测定

根据文献[6]方法，准确称取DPPH 0.02029 mg，用无水乙醇定容至100 mL，配成0.02% DPPH乙醇溶液，避光保存。准确配制一系列质量浓度梯度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)的黄酮提纯液。分别取各浓度待测提取液2 mL，加入DPPH乙醇溶液2 mL，混合均匀后避光静置30 min，以溶剂为对照测定在517 nm处吸光度值A1。然后取各浓度提取液2 mL 与2 mL乙醇溶液混合后测在517 nm处的吸光度值A2。再测2 mL DPPH乙醇溶液与2 mL溶剂混合后在517 nm处的吸光度值A0。自由基的清除率按公式(2)计算。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

式中：A0——自由基发生系统的吸光度

A1——待测吸光度值

A2——对照吸光度值

(3)

式中：A0——空白管吸光度值

A1——样品管吸光度值

A2——待测管吸光度值

2　结果与讨论

2.1羊蹄甲黄酮对·OH的清除能力

表1显示了羊蹄甲黄酮对·OH自由基有较强的清除能力。由表1可知，在一定的浓度范围内,随着各物质浓度的增加，对·OH自由基清除能力逐渐增强。黄酮浓度为24.4 mg/L时，对DPPH自由基抑制率达到18.62%。

表1　对·OH自由基的清除作用

2.2羊蹄甲黄酮对DPPH自由基的清除能力

表2显示了羊蹄甲黄酮提取物有较强地清除DPPH自由基的能力。在一定的浓度范围内,随着各物质浓度的增加，对DPPH自由基清除能力逐渐增强。黄酮浓度为24.4 mg/L时，对DPPH自由基抑制率达到41.74%。

表2　对DPPH自由基的清除作用

表3显示了羊蹄甲黄酮提取物有较强地清除DPPH自由基的能力。在一定的浓度范围内,随着各物质浓度的增加，对DPPH自由基清除能力逐渐增强。黄酮浓度为24.4 mg/L时，对DPPH自由基抑制率达到42.64%。

表3　对超氧阴离子·的清除作用

3　结　论

(1)本实验通过醇提取和超声波方法辅助，能有效提取并得到纯化的羊蹄甲黄酮提取物；

(2)研究结果显示，在一定黄酮剂量范围内，清除自由基能力与剂量存在量效关系,随着添加黄酮量的增加，对自由基的清除能力也在逐渐增强,大夜关门提取物中的黄酮类化合物对DPPH自由基、羟基自由基均有较强的清除能力，提示羊蹄甲黄酮是一种极具有潜力的天然抗氧化剂。

[1]刘杰书,李泳锋.土家苗药夜关门功能的本草学研究与思考[J].时珍国医国药,2010,21(01):197-198.

[2]李楠,刘元,侯滨滨.黄酮类化合物的功能特性[J].食品研究与开发,2005,26(06):139-140.

[3]叶雪芳.植物黄酮类化合物的生物学功能及其在动物生产上的应用研究[A]. 4th International Symposium on Animal Nutrition,Health and Feed Additive[C].2009：607-614.

[4]章文.HPLC法测定夜关门中牡荆苷的含量[J].药品鉴定,2012,19(11)：49-50.

[5]Harmeet K. Sodhi, Kanupriya Sharma. Production of a thermostable α-amylase from Bacillus sp.PS-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the hydrolysis of malt starch for alcohol production process[J].Biochemistry,2005(40):525-534.

[6]王丽.几种黄酮类化合物清除DPPH自由基微量模型的建立[D].郑州:河南大学,2009,

[7]李先辉,李春艳,吕江明,等.黄瓜香水提物体外抗氧化活性实验[J].吉首大学学报(自然科学版),2006,27(5):95-97.

Study on the Extraction of Tujia Medicine Bauhinia Aingredients and Antioxidant in Xiangxi*

WANG Chun-yuan, LI Xin, ZHU Qian, TAN Wu-bing, LUO Yan-hong, HE Ling

(Medical College of Jishou University, Hunan Jishou 416000, China)

Xiangxi Tujia medicine Bauhinia active ingredients were extracted and its antioxidant activity in vitro was determined. The DPPH method, LPO inhibition method and superoxide anion radical clearing method were used to determine the antioxidant activity in vitro of antioxidant. Results showed that the fruit extract antioxidant activity was from strong to weak followed by jujube, wild grapes, citrus, grapefruit, persimmon, kiwi, August melon, snow lotus fruit. Bauhinia has strong antioxidant effect, its effective component is worth for further research and development, and provides the reference to fruit antioxidant research.

Tujia medicine；Bauhinia；antioxidant

2015年吉首大学研究性学习与创新性实验计划项目(77号)；2015年湖南省中医药科研计划项目(201581号)。

王春元(1996-)，女，临床医学专业。

何玲(1969-)，女，副教授，主要从事基础医学教学及实验技术研究。

R931.7

A

1001-9677(2016)01-0071-03