HPLC-DAD法测定化妆品中非法添加的21种磺胺类抗生素

钱叶飞，贾昌平

(苏州市食品药品检验所，江苏　苏州　215104)



HPLC-DAD法测定化妆品中非法添加的21种磺胺类抗生素

钱叶飞，贾昌平

(苏州市食品药品检验所，江苏苏州215104)

建立高效液相色谱法同时测定化妆品中非法添加21种磺胺类抗生素的检测方法。采用Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.9 mL·min-1，柱温为33 ℃，检测波长为268 nm。21种磺胺类成分的线性范围为1.0～40.0 μg·mL-1(磺胺二甲基哒嗪、磺胺喹恶啉和磺胺硝苯的线性为0.5～20.0 μg·mL-1)，相关系数均大于0.99。方法的检出限为0.09～0.36 μg·mL-1，平均回收率在89.1%～112.8%之间，相对标准偏差小于9%。该方法简单，准确，分离效果好，能够满足化妆品中磺胺类物质的检测。

磺胺类药物；高效液相色谱法；化妆品

近年来，许多化妆品品牌推出了防晒、美白、祛斑、祛痘的功效的产品，国内市场日益繁荣，而化妆品也成为人们日常生活中的必备品。然而，有不法商家为谋取暴利，在产品中添加了能增加其功效而可能损害身体健康的物质-磺胺类抗生素。文献表明使用过多的磺胺类抗生素最终会导致人体产生耐药性[1]。我国的《化妆品卫生规范》中也明确规定了磺胺类抗生素为化妆品组分中的禁用物质[2]。这就需要建立一种全面准确检测化妆品中磺胺类物质的分析方法。目前磺胺类药物的检测方法有很多，如滴定法、分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法、流动注射分析法、近红外光谱法、原子吸收光谱法、免疫测定法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等。HPLC法是化妆品中检测磺胺类药物最常用的方法。杨艳伟等[3]采用HPLC法测定化妆品中11中磺胺类化合物。李洁等[4]采用HPLC法同时测定化妆品中9种磺胺。沈宋利等[5]采用超声萃取-高效液相色谱法测定膏类化妆品中14种磺胺类物质。本实验结合前人工作经验，采用较为常用的HPLC-DAD法，建立同时测定化妆品中非法添加21种磺胺类抗生素的分离检测方法，并进行方法学验证。用此方法对市场上的13种祛痘类化妆品进行检测，结果表明该方法简单，准确，分离效果好，能够较为全面监测化妆品中磺胺类抗生素。

1　实　验

1.1仪器、试剂与材料

Waters e2695型高效液相色谱仪，配有2998 型二极管阵列检测器，Waters公司，Synergy system型超纯水仪，密理博公司，KQ-300DA型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，Thermo Scientific HERAEUS BIOFUGE PRIMOR型高速离心机；甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯，其他试剂为分析纯，实验用水为超纯水。

21种磺胺对照品：磺胺、磺胺胍、磺胺乙酰、磺胺嘧啶、磺胺二甲异嘧啶钠、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺甲恶唑、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲异恶唑、磺胺多辛、磺胺二甲基哒嗪、磺胺硝苯、磺胺喹恶啉，均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

对照溶液制备：分别精密称取21种磺胺类药物对照品10 mg，分别置10 mL棕色容量瓶中，加入适量2%甲醇溶液，涡旋使溶解，加2%甲醇溶液至刻度。即得质量浓度为1 mg·mL-1的标准储备液(注：其中磺胺胍需加入盐酸溶液溶解，而琥珀酰磺胺噻唑、磺胺喹噁啉、磺胺硝苯则需加入氢氧化钠溶液使之溶解)。

取上述对照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中(磺胺二甲基哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺硝苯各取0.5 mL)，加2%甲醇溶液至刻度，混匀，即得磺胺二甲基哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺硝苯浓度均为20 μg·mL-1，而其他18种对照品的质量浓度均为40 μg·mL-1的混合对照品储备液。

1.2样品处理

准确称取化妆品约1.0 g于10 mL刻度离心管中，加入2%甲醇溶液适量，涡旋，加甲醇溶液至刻度，摇匀(必要时可加入氯化钠破乳)，于15000 r·min-1高速离心10 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液供高效液相色谱测定。整个操作在避光条件下进行。

加标样品：精密称取阴性样品约1.0 g，置10 mL刻度离心管中，加入一定量的混合对照品溶液，再加入适量2%甲醇溶液，涡旋，定容至刻度。将溶液以15000 r·min-1高速离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜，取续滤液用于高效液相色谱测定。

1.3实验条件

图1　21种磺胺标准品混合色谱图

色谱条件：色谱柱：Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸为流动相B，进行梯度洗脱0～6 min 3%A，6～15 min 3%～19%A，15～22 min 19%～23% A，22～26 min 23%～24% A，26～34 min 24% A，34～36 min 24%～60% A，36～45 min 60%～95% A，45～50 min 95% A；流速：0.9 mL·min-1；柱温：

33 ℃；样品室温度：4 ℃；进样量：20 μL；检测波长：268 nm。将混合对照品溶液在该条件下进样测定，记录色谱图(见图1)，从色谱图中可以看出21种标准物质分离良好。

2　结果与讨论

2.1实验条件的考察

2.1.1色谱条件的优化

检测器选择二极管阵列检测器，是因为与传统的紫外检测比较，其能够对色谱峰进行光谱扫描，且扫描所得的特征吸收峰能够进一步了解物质的信息，可增强方法的专属性。磺胺类药物在250～290 nm波长区间有较强的吸收，考虑所有物质的紫外吸收，选择268 nm较为合适。

由于所分析的21种磺胺类抗生素极性差异较大，所以采用梯度洗脱。为了获得良好的分离效果，本实验对流动相进行了优化。有机相选择了甲醇，可获得良好分离效果。考虑到磺胺类药物的结构中含有伯胺基和磺酰胺基，呈酸碱两性，在水相中加入酸，可以抑制弱碱性的氨基解离。本实验参照文献比较了0.1%甲酸[6]、0.1%磷酸[7]、0.1%乙酸[8]添加到含水流动相中的分离情况，0.1%磷酸和0.1%乙酸分离效果均不理想。最终确定选用0.1%甲酸为水相。

色谱柱温的变化会直接影响磺胺类抗生素的分离效能和分析速度，温度升高，化合物保留时间缩短，分离度减小，可能影响基线分离；温度降低，可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高。本实验分别考察柱温为30 ℃、33 ℃和35 ℃时的分离情况。比较不同温度下的色谱图，可以看出，33 ℃的柱温是最好的选择。

2.1.2提取溶剂的选择

磺胺类药物是含有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物，对光不稳定，所以在配制对照品溶液时，要避光操作。因大多数磺胺类药物能溶于甲醇，首先选择了50%的甲醇溶液，然而，进样检测后发现，出现了很强的溶剂效应，严重影响了弱保留物质的峰型。降低甲醇的百分含量，选用2%甲醇作为提取溶液，达到了很好的效果。期间，对于一些难溶的磺胺类药物，加酸(盐酸)或加碱(氢氧化钠)使之溶解。对于大多数化妆品，以2%甲醇水溶液提取，高速离心后，上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，进样。

2.2方法学考察

2.2.1线性

将上述“1.1”中配制好的混合对照品储备液逐级稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1，其中磺胺二甲基哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺硝苯的质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg·mL-1。将这一系列不同质量浓度的混合标准溶液进样测定，记录色谱图，以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标，进行线性拟合，从而得到线性方程和相关系数。磺胺二甲基哒嗪、磺胺喹恶啉和磺胺硝苯的线性范围为0.5～20.0 μg·mL-1，其余成分的线性范围为1.0～40.0 μg·mL-1。结果见表1。

表1　21种磺胺类标准品线性关系、LOD、LOQ、精密度、回收率及稳定性

2.2.2检出限(LOD)与定量限(LOQ)

取阴性样品按“1.2”中加标样品的制备方法，加入稀释一定倍数混合对照品溶液，进样，测定其信噪比。根据测得的信噪比，按比例相应的减小或增加进样浓度，根据21种对照品S/N=3时溶液浓度计算检出浓度，S/N=10时溶液浓度计算定量浓度，结果见表1。

2.2.3回收率和精密度试验

以不含磺胺类药物非法添加的化妆品为基质，分别在3个添加水平进行回收率测定。磺胺二甲基哒嗪、磺胺硝苯、磺胺喹恶啉3个添加水平为0.5、1、2.5 μg·mL-1，其余均为1、2、5 μg·mL-1，结果发现21种物质的平均回收率在89.1%～112.8%之间，相对标准偏差小于9%(详见表1)，表明方法的准确度较好。将混合对照品溶液按“1.3”的色谱条件，连续进样6次，记录各物质色谱峰面积。结果显示，各化合物的峰面积RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好，结果见表4。

2.2.4稳定性

磺胺类抗生素本身是不稳定的物质，遇光容易发生变质，易降解。针对物质的不稳定性，本次实验采取了两个措施，第一，整个实验过程中避光操作；第二，HPLC的样品室温度调至4 ℃。在该条件下，取浓度为1.0、10.0、40.0 μg·mL-1的磺胺对照品混合溶液，于自动进样器中，分别于1、2、4、8、12、24 h进样，计算峰面积，考察24 h的稳定性，结果显示稳定性良好。

2.3样品测定

按照“1.2”方法处理样品，并在“1.3”条件下进样测定，根据样品的色谱图和光谱图来判断样品中是否含有磺胺类药物。选择了市场上13种祛痘类化妆品进行检测，首先根据保留时间比对色谱峰，然后，比较疑似峰与目标物质峰的光谱图，进一步确认。结果13种化妆品均未检出21种磺胺类药物。

3　结　论

本文建立了HPLC-DAD同时检测化妆品中非法添加21种磺胺类抗生素的方法。通过单因素实验对影响色谱分离及化合物提取的主要因素做了考查，最终确定了合适的流动相种类、柱温、洗脱梯度及提取溶剂，取得了良好的分离效果。对所建立的分析方法进行的方法学验证表明该方法线性回收率良好、灵敏度高，适用于化妆品中非法添加磺胺类抗生素的定性、定量检测，为化妆品监管、规范化妆品市场及维护消费者的切身利益提供有力的技术支撑。

[1]J E Hyde, P F Sims.Sulfa-drug resistance in plasmodium falciparum[J].Trends in Parasitology,2001,17(6)：265-266.

[2]中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范[S].2007.

[3]杨艳伟,朱英.HPLC法测定化妆品中11种磺胺类化合物[J].中国卫生检验杂志,2006,16(11):1343-1344.

[4]李洁,王萍,郑和辉.HPLC法同时测定化妆品中9种磺胺[J].中国卫生检验杂志,2009,19(11):2526-2527.

[5]沈宋利,卢珩俊,陶松,等.超声萃取-高效液相色谱法测定膏类化妆品中14种磺胺类物质[J].分析试验室,2013,32(10):121-124.

[6]马强,王超,王星,等.化妆品中21中磺胺类药物的高效液相色谱检测及质谱确证[J].分析测试学报,2008,27(S1):211-215.

[7]李俊锁,李西旺,魏广智,等.鸡肝组织中磺胺类药物多残留分析法[J].畜牧兽医学报,2002,33(5):468-472.

[8]杨晓松,余辉菊,邱莎.基质固相分散萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定动物性食品中磺胺类药物残留[J].中国卫生检验杂志,2013,23(5):1109-1112.

Determination of 21 Sulfonamides Illegally Added into Cosmetics by HPLC-DAD

QIANYe-fei,JIAChang-ping

(Suzhou Institute for Food and Drug Control, Jiangsu Suzhou 215104, China)

To establish a method for determination of 21 sulfonamides illegally added into cosmetics, the high performance liquid chromatography with photodiode array detector (HPLC-DAD) was adopted. The analysis was performed on a waters symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)column with methanol and 0.1% formic acid aqueous solution as mobile phase by gradient elution. The flow rate was 0.9 mL·min-1and column temperature was 33 ℃. The detection wavelength was set at 268 nm. The linearity ranged from 1.0 to 40.0 μg·mL-1, with correlation coefficients more than 0.99. The limits of quantification were 0.09～0.36 μg·mL-1. The average recoveries at three spiked levels ranged from 89.1% to112.8% with RSDs of less than 9%. The method was simple, accurate and had a good separation efficiency, which can be used for the determination of sulfonamides added into cosmetics.

sulfonamides; high performance liquid chromatography(HPLC); cosmetics

钱叶飞(1987-)，男，中药师，主要从事化妆品检验工作。

贾昌平(1984-)，男，博士，主管药师，主要从事化妆品检验方法开发。

TQ658

A

1001-9677(2016)010-0150-03