HPLC法测定不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量*

王　宁，谢春玉，丁　静，任　燕

(滨州医学院，山东　烟台　264003)



HPLC法测定不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量*

王宁，谢春玉，丁静，任燕

(滨州医学院，山东烟台264003)

采用高效液相色谱技术，测定不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，乙腈(A)-水溶液(0.1%醋酸，B)为流动相，梯度洗脱(0～60 min，5%～30%A；60～70 min，30%～100%A)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长335 nm，进样量20 μL。结果不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量分别为江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江苏0.91%、山东1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。本实验所建立的方法简单、准确，能为评价半枝莲的内在质量提供一定的依据。

半枝莲；野黄芩苷；高效液相色谱

半枝莲是唇形科植物半枝莲Scutellaria barbarta D. Don的干燥全草。别名通经草、紫连草等[1]，性辛、寒，味苦，有清热解毒、化瘀利尿的功效，半枝莲常用于疔疮肿毒，咽喉肿痛等的治疗[2]。现代药理学证明半枝莲药理作用广泛，具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒和免疫调节等方面的作用[3]。《中华人民共和国药典》2015版中，半枝莲药材的质量主要通过总黄酮及野黄芩苷的含量来评价。黄酮类化合物是半枝莲中主要的有效成分，含量最多的为野黄芩苷[4-7]。半枝莲中野黄芩苷含量的高低与其疗效有相关性。为评价半枝莲的质量，本实验采用高效液相色谱法对八个不同来源的半枝莲药材中的野黄芩苷进行了含量测定，为充分利用半枝莲药材资源提供一定的参考。

1　实　验

1.1仪器与试药

Waters 高效液相色谱仪；KQ5200B型超声清洗器,昆山市超声仪公司；TDL-4低速台式离心机,上海安亭科学仪器厂；TB-215D电子分析天平,丹佛仪器有限公司。

野黄芩苷(批号：S107670)购自上海晶纯生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，乙酸为分析纯，水为超纯水。药材来自四川、山东、河南等8 个产区，由滨州医学院药学院生药学教研室陈彩云鉴定为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D. Don的干燥全草。

1.2实验方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水溶液(0.1%醋酸)，梯度洗脱(0 min，乙腈5%，水95%；60 min，乙腈30%，水70%；70 min，乙腈100%)；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为335 nm；进样量为20 μL。色谱图见图1。

图1　半枝莲样品(A)和野黄芩苷对照品(B)的HPLC图Fig.1　The HPLC chromatogram of scutellaria barbata (A) and scutellarin (B)

1.2.2对照品溶液的制备

准确称取野黄芩苷对照品2 mg，加甲醇定容至10 mL，配制成浓度为200 μg/mL的对照品标准储备溶液。储备溶液用甲醇按一定比例稀释，最终配制成浓度为2、4、20、50、100、200 μg/mL的系列浓度对照品工作溶液。

1.2.3供试品溶液的制备

分别精密称取不同产地半枝莲粉末约0.05 g，置于10 mL离心管中，然后加入70%甲醇5 mL，摇均后超声1.5 h，提取液4500 rpm离心10 min，取上清液即为供试品溶液。

1.2.4线性关系考察

精密吸取野黄芩苷系列浓度对照品工作溶液20 μL，注入高效液相色谱，根据上述的色谱条件进行测定，以野黄芩苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=60647X+118064，R=0.9936。结果说明野黄芩苷在2.04～204.5 μg/mL线性关系良好。标准曲线见图2。

图2　野黄芩苷标准曲线Fig.2　The calibration curve of scutellarin

1.2.5精密度试验

表1　精密度试验结果(n=6)Table 1　The results of precision (n=6)

取同一浓度的野黄芩苷对照品溶液(浓度：20 μg/mL)，连续进样6次，野黄芩苷峰面积的RSD为3.96%，表明仪器精密度良好。结果见表1。

1.2.6重复性试验

取同一产地的半枝莲样品(河南)，按“1.2.3供试品溶液的制备”方法处理，平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，结果野黄芩苷峰面积的RSD为3.45%，表明重复性良好。结果见表2。

表2　重复性实验结果(n=6)Table 2　The results of repeatability (n=6)

1.2.7稳定性试验

取半枝莲样品(河南)一份，按“2.3供试品溶液的制备”方法处理，分别于0、4、8、12、16、20 h分别测定，结果野黄芩苷峰面积的RSD值为4.02%，表明样品处理后20小时内稳定。结果见表3。

表3　稳定性实验结果(n=6)Table 3　The results of stability (n=6)

1.2.8加样回收率测定

精密称取已知含量的样品(河南)6份，分别加入与供试品等量的对照品，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积，根据标准曲线计算加样收率，其回收率在100.0%～108.1%(RSD=3.14%)，表明测定方法稳定可靠。结果见表4。

表4　加样回收试验结果(n=6)Table 4　The results of recovery (n=6)

1.2.9样品的测定

精密称取不同产地的半枝莲样品，照“1.2.3”项下方法制成供试品溶液，照“1.2.1”项下色谱条件，测定含量，结果见表5。

表5　不同产地半枝莲中野黄芩苷含量测定结果Table 5　The contents of scutellarin in herba scutellaria barbata from different places

2　结果与讨论

2.1样品前处理方法的优化和选择

分别精密称取等量的同一种半枝莲粉末，置于10 mL离心管，然后分别加入70%甲醇和95%甲醇5 mL，超声1.5 h，4500 rpm离心10 min，取上清液在相同的色谱条件下进行测定，结果采用70%甲醇超声提取峰面积相对较大。最终确定提取条件为70%甲醇超声提取1.5 h。

2.2流动相的选择

本实验直接采用乙腈(A)-水(0.1%醋酸，B)作为流动相系统，通过更改洗脱梯度来进行优化和选择。本实验分别采用条件1(0 min，5%A；60 min，30%A；70 min，100%A)和条件2(0 min，5%A；5 min，15%A；70 min，40%A；80 min，60%A)来分离半枝莲中的野黄芩苷。根据实验结果，采用条件1分离效果良好，半枝莲与其他成分达到基线分离，且分析时间相对较短，所以最终选择此条件作为本实验的流动相的洗脱条件。

2.3检测波长的选择

本实验直接采用文献报道的野黄芩苷[7]的检测波长335 nm作为检测波长。

2.4含量测定

根据测定结果可以看出，各产地半枝莲中野黄芩苷的含量均超过了0.30%，达到了《中华人民共和国药典》2015版中规定的半枝莲药材中野黄芩苷含量的要求。本次实验测定的8个产地半枝莲中野黄芩苷的含量分别为：江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江苏0.91%、山东1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。由结果可以看出，不同地区半枝莲中野黄芩苷的含量差别较大，山东产地的半枝莲药材中野黄芩苷的含量最高，这提示我们在中药复方及成方制剂中应尽可能的选择山东产半枝莲，在所需的半枝莲的量相同的情况下药效能相应得到提高，保证临床用药的安全性与有效性。

3　结　论

本实验建立了HPLC法测定不同产地半枝莲中野黄芩苷的含量测定方法。样品前处理方法简单，分析时间适宜，所建立的方法简便、灵敏、准确，适合对不同产地半枝莲中的野黄芩苷进行准确的含量测定，实验结果为半枝莲的质量评价提供了一定的依据。

[1]黄泰康. 常用中药成分与药理手册[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 1997:127.

[2]邸多隆,刘春丽, 刘晔玮,等. 半枝莲提取工艺的研究[J]. 中成药, 2003, 25(7): 530-532.

[3]杨连梅,刘量,胡荣,等. 半枝莲化学成分的提取和含量测定方法研究[J]. 江苏中医药, 2010, 42(2): 78-79.

[4]杨连梅, 刘量, 胡荣, 等. 半枝莲化学成分的提取和含量测定方法研究[J]. 江苏中医药, 2010, 42(2): 78-79.

[5]H Yao, S Li, J Hu, et al. Chromatographic fingerprint and quantitative analysis of seven bioactive compounds of Scutellaria barbata[J]. Planta Med, 2011, 77(4): 388-393.

[6]F Zhu, Y-T Di, L-L Liu. Cytotoxic neoclerodane diterpenoids from Scutellaria barbata[J]. J Nat Prod, 2010, 73(2): 233-236.

[7]李守拙, 潘海峰. HPLC测定半枝莲中野黄芩苷的含量[J]. 中草药, 2003, 34(2): 183-184.

Determination of Contents of Scutellarin in Herba Scutellaria Barbata from Different Places by HPLC

WANGNing,XIEChun-yu,DINGJing,RENYan

(Binzhou Medical University, Shandong Yantai 264003, China)

The content of scutellarin of herba scutellaria barbata derived from different places was determined by HPLC. The analysis was carried out on an Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) eluted with acetonitrile-water (0.1% acetic acid) in linear gradient condition (0～60 min, 5%～30%A, 60～70 min, 30%～100%A). The detection wavelength was 335 nm, the temperature of the column oven was 30 ℃, the flow rate was 1 mL·min-1, and the sample injection volume was 20 μL. As a result, the contents of scutellarin in herba scutellaria barbata from Jiangxi, Henan, Hunan, Sichuan, Jiangsu, Shandong, Heibei, Anhui were 1.08%, 0.74%, 1.06%, 0.61%, 0.91%, 1.66%, 0.39%, 0.54%, respectively. The established method was simple, accuracy, and the results can provide useful reference date for evaluate the intrinsic quality of herba scutellaria barbata.

scutellaria barbata; scutellarin; HPLC

山东省高等学校科技计划(J13LL80)；山东省自然科学基金(ZR2013HL006)。

王宁(1992-)，女，滨州医学院学生，药学专业。

任燕(1982-)，女，滨州医学院讲师，博士学位，主要从事药物分析研究。

R917

A

1001-9677(2016)08-0117-03