艰难梭菌在肠易激综合征和炎症性肠病患者中的感染情况及与白细胞介素-8基因-251 A/T多态性的关系研究

韦舒静　董利军　鲁晓岚　曹　璋



·论著·

艰难梭菌在肠易激综合征和炎症性肠病患者中的感染情况及与白细胞介素-8基因-251 A/T多态性的关系研究

韦舒静董利军鲁晓岚曹璋

目的探讨艰难梭菌(C.difficile)在肠易激综合征(IBS)和炎症性肠病(IBD)患者中的感染情况及与白细胞介素8(IL-8)基因-251 A/T多态性的关系。方法研究选取经澄城县人民医院消化内科及肛肠科诊断为IBS、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)的患者(分别为76 例、90 例、83 例)，同时选取90位健康志愿者作为对照组，比较C.difficile在各组中的感染情况，探讨C.difficile感染与基因位点多态性的关系。结果UC 组、CD 组的感染率显著高于IBS 组和对照组(P<0.05)，而IBS 组与对照组的C.difficile感染率差异无统计学意义(P>0.05)，UC 组与CD组的感染率差异亦无统计学意义(P>0.05)。UC组血液中IL-8的浓度高于CD 组、IBS 组及对照组，而CD 组的浓度高于IBS 组和对照组，IBS 组及对照组血液中IL-8浓度的差异无统计学意义(P>0.05)。结论C.difficile感染可使患者血液中IL-8浓度升高，IL-8基因-251 A/T多态性AA基因型是C.difficile感染的危险因素。

艰难梭菌；肠易激综合征；炎症性肠病；感染率；白细胞介素8；多态性

近年来，由于抗生素在中国使用较频繁且广泛，艰难梭菌(C.difficile)相关性疾病的发病率也呈逐年升高趋势，并出现了新的毒力更强的菌株[1-3]。目前尚缺乏强有力的研究数据以准确、有效地评估在中国的不同人群中C.difficile的感染情况及危险因素，因此尚不能准确、全面地预防和治疗C.difficile相关性疾病[4-6]。本研究探讨了C.difficile在肠易激综合征(IBS)患者、炎症性肠病(IBD)患者及健康人群中的感染情况，并调查其感染的危险因素，为IBS、IBD的早期诊断及预防提供了科学依据，对于进一步控制C.difficile感染相关性疾病的发病率和病死率具有重要的理论和实践指导意义。

1　材料及方法

1.1材料

收集2011年10月至2013年2月在澄城县人民医院消化内科及肛肠科被诊断为IBS 及溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)患者的粪便及血液标本，其中最终纳入研究的IBS 患者共有76 例，UC 患者共90 例，CD 患者共83例，同时收集90位健康志愿者的粪便及血液标本。C.difficile标准菌株购自中国微生物菌种保藏中心。

1.2方法

1.2.1标本的采集及储存收集所有入选的人群未使用任何药物前的第1次排便的粪便，用无菌便盒收集新鲜的粪便>500 mg(或水样便>500 μL)，并于30 min内置于-80℃冰箱冻存，待测；收集入选人群血液2 mL，置-80℃冰箱冻存，待测。尽量避免反复冻融。

1.2.2粪便基因组DNA的提取步骤按照粪便基因组DNA 提取试剂盒说明书操作。

1.2.3C.difficile标准菌株的培养培养基配方：蛋白胨15 g、酵母粉5 g、大豆胨5 g、牛肉粉5 g、葡萄糖5 g、氯化钠5 g、可溶性淀粉3 g、半胱氨酸0.5 g、磷酸二氢钾2.5 g、氯化血红素0.005 g、维生素K1 0.001 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。复苏培养：用无菌吸管吸取约0.5 mL的液体培养基于安瓿管中使干燥菌种全部溶解，溶解后吸出并放入盛有4～5 mL液体培养基的试管中，置于36℃厌氧培养箱中培养48 h。

1.2.4聚合酶链法检测C.difficile毒素设计针对C.difficile毒素B保守区的引物，以提取的粪便基因组DNA 为模板，其中阳性对照及阴性对照的模板分别以C.difficile标准菌株基因组DNA 及超纯水代替，按照试剂盒要求进行操作。

1.2.5酶联免疫吸附法检测C.difficile毒素按照试剂盒要求进行操作，有效性判断：阳性对照孔(B孔)平均值≥1.00，阴性对照孔(A孔)平均值≤0.10。临界值=阴性对照孔平均值+0.15。阴性判定：样品光密度(OD)值<临界值者为C.difficile毒素阴性；阳性判定：样品OD值≥临界值者为C.difficile毒素阳性。

1.2.6酶联免疫吸附法检测血液中白细胞介素-8的浓度按照试剂盒要求进行操作，以白细胞介素-8(IL-8)标准品的浓度及对应的OD 值，计算出标准曲线的直线回归方程式，然后根据样品的OD值，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.2.7Sanger方法检测IL-8基因-251 A/T 多态性以单条DNA 链为模板，合成其互补链，在合成原料(2′脱氧核苷酸)中掺入已用不同颜色荧光标记过的2′3′双脱氧核苷酸，然后进行延伸反应，而合成互补链的反应会随机终止，从而能够在终止处得到大量的带有标志物的DNA 片段，这些DNA片段长度不一，但仅相差1个bp，通过高分辨率的电泳分离，根据标志物的不同荧光颜色可测出碱基的序列，从而得到DNA 的序列。将扩增成功的样品送测序公司测序。用DNAMAN软件进行序列比对，同时打开峰图查看待检测位点的荧光信号。

1.3统计学分析

2　结果

2.1基本资料

在所有的入选对象中，IBS 组共76例，其中男性37 例，女性39 例，平均年龄(32.72±4.06)岁；UC 组共90例，其中男性48例，女性42例，平均年龄(36.28±3.04)岁；CD组共83例，其中男性39例，女性44例，平均年龄(35.71±5.98)岁，正常对照组共90例，男、女各45例，平均年龄(34.56±4.37)岁。以疾病的严重程度区分，UC组病情为轻型的有17 例、中型41例、重型32例，而CD组轻、中、重型分别有43例、32例、8例，因此，UC 组的病情较CD 组更严重，可能会对本研究结果产生一定的影响。在UC患者和CD患者中，近期使用过质子泵抑制剂(PPI)的分别有39例、36 例，长期使用激素灌肠治疗的分别有20 例、18 例，近期使用全身性糖皮质激素的分别有36 例、35 例，近期使用免疫抑制剂的分别有29 例、31 例，两组中联合使用激素及免疫抑制剂的均为8 例。UC 组中为初发患者的有18 例，CD 组有21 例；UC 组中疾病处于复发活动期的有51 例，CD 组有40 例。

2.2C.difficile的感染情况

各组患者的C.difficile感染率不同，由高到低依次为UC 组、CD 组、IBS 组、正常组。UC 组、CD 组的感染率显著高于IBS 组和对照组(P<0.05)，而IBS 组与对照组的C.difficile感染率差异无统计学意义(P>0.05)，UC 组与CD组的感染率差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1　各组C.difficile感染情况比较

注：与正常组相比较，aP<0.05；与IBS组相比较，bP<0.05

注：图1A、图1B均左起依次编号，第1孔为MarkerⅠ，第2孔为阳性对照，第3孔为阴性对照，第4至第8孔为标本；MarkerⅠ最亮条带处为400 bp。图1A：阳性对照产物为173 bp，阴性对照无条带出现，该组标本均无条带出现，该组标本均未感染C.difficile；图1B：阳性对照产物为173 bp，阴性对照无条带出现，标本孔第4、5、6、7 孔均未出现条带，为未感染C.difficile标本，第8 孔出现目的条带，为C.difficile感染阳性。

图1PCR 扩增检测C.difficile毒素B 电泳图

2.3血液中IL-8 浓度的比较

UC组血液中IL-8 浓度相较于CD 组、IBS 组和对照组高，且差异有统计学意义(F=24.944，P<0.01)，UC 组和CD 组浓度较IBS组和对照组高，且差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。这可能与不同疾病有关，若IBD患者的肠道黏膜炎性反应较严重，则受损更加严重，细胞连接被破坏，产生更多的IL-8。

表2　各组血液中IL-8浓度比较/ng·L-1

注：与正常组相比较，aP<0.01；与IBS组相比较，bP<0.01。Q1、Q3 分别是25%、75%百分位数。

UC 组患者中，C.difficile感染阳性患者血液中IL-8浓度高于未感染者，差异具有统计学意义(t=15.79，P<0.01)。CD 组患者中，C.difficile感染阳性患者血液中IL-8浓度高于未感染者，差异具有统计学意义(t=14.73，P<0.01)。见表3。

表3　UC 组、CD 组中阳性、阴性之间IL-8 浓度的比较

注：与阴性组相比较，aP<0.01

2.4C.difficile阳性、阴性者之间IL-8 基因-251 A/T 多态性研究

研究在所有C.difficile阳性者与阴性者之间进行比较，在31例阳性感染者中，AA、AT、TT 基因型所占比例依次为64.5%(20/31)、19.4%(6/31)、16.1%(5/31)；由此可知，C.difficile阳性感染者中血液IL-8基因-251位点多态性最多的基因为AA 型，其次为AT 型。研究结果提示，人血液中IL-8 基因-251 位点AA 基因型是C.difficile感染的一个危险因素。见表4。

表4　各组中C.difficile阳性、阴性者

注：与阴性组相比较，aP<0.05

3　讨论

C.difficile感染的相对危险因素包括使用广谱抗生素、伴有严重的基础疾病、使用PPI、处于免疫抑制状态、使用激素、老龄、近期有手术史以及出现毒力更强的新型产毒菌株等[1]。近年来的研究将一些暴露于肠道病原体和胃肠道感染后引起的IBS与“感染后IBS”的概念相结合。肠道微生物的改变和黏膜免疫反应已用于阐述IBS的发病机制，这种变化导致宿主和肠腔菌群之间关系紊乱，而这些可由肠胃炎进展而来，即一部分IBS可由肠胃炎治愈后进展而来[2-4]。C.difficile感染可导致肠道炎性反应，增加了肠道黏膜的通透性，使中性粒细胞聚集，破坏细胞之间的连接。而宿主体中缺少IgG抗体反应是初发和复发性C.difficile感染的一个重要的免疫学因素[5]。本文对C.difficile在IBS患者中的感染情况进行研究，旨在探讨在IBS患者中是否会有更高的C.difficile感染率，以及IBS是否可作为C.difficile感染的一个危险因素。通过研究发现，虽然从研究结果可知IBS患者的感染率约是正常人群的两倍，但两者之间的差异却无统计学意义(P>0.05)，这可能是由于本研究受到样本量较小的限制。Clayton等[6]的研究纳入了没有相关危险因素的87例IBS患者，检测出有5例感染C.difficile(5.7%)，其中有4例是产毒菌株(4.6%)，而在88例正常对照组中检出1例C.difficile感染阳性(1.1%)。

IBD包括UC和CD，其发病机制尚不明确。IBD患者经常因腹痛、腹泻而住院，但其始发因素可能是基础性疾病或者是感染了肠道的微生物或条件致病菌(如C.difficile)。在IBD患者中发现有越来越多的C.difficile感染者，C.difficile感染对于IBD患者的影响至今尚不清楚，但IBD患者具备很多C.difficile感染的危险因素，因此可以推测，IBD患者更容易感染C.difficile。因为大多数IBD患者的复发常常不能与C.difficile感染相区分，所以使部分研究较少意识到在IBD患者中C.difficile的感染情况。有研究报道在IBD的发病中，C.difficile感染占了5%～19%[7]。本研究中UC患者的C.difficile感染率并不高，这可能与样本量较小、检测方法不同以及纳入的研究对象的病情轻重程度有关。

IL-8是一种炎性因子，在中性粒细胞趋化以及炎性反应过程中起着重要作用，但IL-8基因的多态性与C.difficile感染之间的关系尚不清楚。有研究表明，IL-8基因启动区-251位点与人粪便中IL-8浓度增高有关[8]，而这可能与在入选研究对象时，UC组患者的病情程度较CD组严重有关。炎性反应严重时，必然会导致细胞连接破坏加重，将有更多的中性粒细胞聚集，IL-8浓度也将随之增高。本研究纳入的研究对象中UC组患者的病情较CD组严重，对血液中IL-8浓度也会产生一定的影响。

此外，本文对各组中C.difficile阳性和阴性者的血液IL-8基因-251位点多态性的差异进行了研究。结果指出，各组中除了对照组由于阳性例数过少，其他3组的阳性感染者中AA基因型所占比例较大，提示IL-8基因-251 A/T多态性AA基因型更容易发生C.difficile感染。

C.difficile感染相关性疾病的发病率越来越高，其危害性及所带来的医疗负担也越来越严重，及时、准确地了解C.difficile的感染情况及危险因素，能够为C.difficile感染的预防、治疗提供更好的帮助，对减少其发病率、提高治愈率有着重要意义。综上所述，C.difficile在IBD患者中有较高的感染率；C.difficile感染所引发的炎性反应可增加各组阳性患者血液中IL-8的浓度；IL-8基因-251 A/T的多态性与C.difficile感染有关，该位点为AA基因型者更容易感染C.difficile，即IL-8基因-251 AA基因型是C.difficile感染的一个危险因素。

1 郭桂萍, 董创创, 戴洁, 等. 艰难梭菌毒素A C端结构域在大肠杆菌中的可溶性表达与卵黄抗体的制备[J].军事医学, 2013, 37: 676-680.

2 Parkes GC, Brostoff J, Whelan K, et al. Gastrointestinal microbiota in irritable bowel syndrome: their role in its pathogenesis and treatment[J]. Am J Gastroenterol, 2008, 103: 1557-1567.

3 Quigley EM. Bacterial flora in irritable bowel syndrome: role in pathophysiology, implications for management[J]. J Dig Dis, 2007, 8: 2-7.

4 Spiller RC. Role of infection in irritable bowel syndrome[J]. J Gastroenterol, 2007, 42: 41-47.

5 Kyne L, Warny M, Qamar A, et al. Asymptomatic carriage ofClostridiumdifficileand serum levels of IgG antibody against toxin A[J]. N Engl J Med, 2000, 342: 390-397.

6 Clayton EM, Rea MC, Shanahan F, et al. Carriage ofClostridiumdifficilein outpatients with irritable bowel syndrome[J]. J Med Microbiol, 2012, 61: 1290-1294.

7 钟岚, 徐文, 王炜, 等. 罗马Ⅲ标准诊断的肠易激综合征患者中无致病性难辨梭状芽孢杆菌感染[J]. 胃肠病学, 2010, 15: 160-162.

8 Mylonaki M, Langmead L, Pantes A, et al. Enteric infection in relapse of inflammatory bowel disease: importance of microbiological examination of stool[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2004, 16: 775-778.

(本文编辑：周骏)

Clostridium difficile in patients with IBS, IBD infection situation and with IL-8 gene-251 A/T loci polymorphismWEIShujing.DepartmentofGastroenterology,People′sHospitalofChengchengCounty,Weinan(715200),China;DONGLijun.DepartmentofPharmacy,People′sHospitalofChengchengCounty,Weinan(715200),China;LUXiaolan.DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an(710065),China;CAOZhang.DepartmentofPathologyTeachingandResearchSection,BinzhouMedicalCollege,Binzhou(256603),Shandong,China

ObjectiveAn attempt was made in this paper to investigate the clostridium difficile (C.difficile) bacteria in patients with irritable bowel syndrome (IBS), inflammatory bowel disease(IBD) infection situation and with IL-8 gene-251 A/T loci polymorphism. MethodsSeventy-six cases of IBS, ninety cases of ulcerative colitis(UC), eighty-three cases of Crohn′s disease(CD), and ninety cases of normal population were selected and the C. difficile infection in each group was compared to find out the relationship between C. difficile infection and polymorphic loci. ResultsThe infection rate of the UC group and CD group were higher than that of the IBS group and the normal group (P<0.05). There is no significant difference in C. difficile infection rate between the UC group and the CD group (P>0.05). The IL-8 in the UC group was higher than that in the CD group, the IBS group, and the normal group. There is no significant difference in IL-8 between the IBS group and the normal group (P>0.05). ConclusionC. difficile infection can increase the IL-8 and IL-8 gene -251 A/T is the risk factor for C. difficile infection.

Clostridium difficile; Irritable bowel syndrome; Inflammatory bowel disease; Infection rate; IL-8; Polymorphism

山东省自然科学基金青年基金项目(ZR2011HQ025)

715200陕西省渭南市澄城县人民医院消化内科(韦舒静)；715200陕西省渭南市澄城县人民医院药剂科(董利军)；710065陕西省西安交通大学第二附属医院消化内科(鲁晓岚)；256603山东省滨州市滨州医学院病理学教研室(曹璋)

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.013

2015-06-10)