裸鼠肾被膜下阴茎海绵体组织和盆神经节移植的可行性

许永德，关瑞礼，吴元翼，雷洪恩，杨璧铖，李辉喜，王　林，郭应禄，辛钟成△

(1. 北京大学第一医院男科中心， 北京　100034； 2. 中国人民解放军总医院基础研究所， 北京　100853； 3. 中国人民解放军总医院第一附属医院泌尿外科， 北京　100037)



·技术方法·

裸鼠肾被膜下阴茎海绵体组织和盆神经节移植的可行性

许永德1，2，关瑞礼1，吴元翼3，雷洪恩1，杨璧铖1，李辉喜1，王林1，郭应禄1，辛钟成1△

(1. 北京大学第一医院男科中心， 北京100034； 2. 中国人民解放军总医院基础研究所， 北京100853； 3. 中国人民解放军总医院第一附属医院泌尿外科， 北京100037)

目的：基于组织异体移植技术，研究将正常SD(Sprague-Dawley)大鼠阴茎海绵体组织和盆神经节移植到Nu/Nu裸鼠肾被膜下的可行性。方法：无菌条件下获取SD大鼠阴茎组织和盆神经节，在手术显微镜下将上述组织移植到Nu/Nu裸鼠肾被膜下，分别于移植后1周和4周检测移植物的组织病理学变化及移植物内部细胞增殖情况。结果：移植1周后，移植到Nu/Nu裸鼠肾被膜下的阴茎海绵体组织与正常阴茎海绵体组织形态一致，在阴茎海绵体窦内充满血液；移植4周后，靠近肾的阴茎海绵体组织接近正常组织形态，而远离肾的阴茎海绵体组织表现为纤维化，仍可在阴茎海绵体窦观察到血液。盆神经节移植后1周，移植物内部组织结构与正常盆神经节相近，可见多个“细胞团”样结构存在，在靠近肾的部位有新生血管样结构形成；移植后4周，在远离肾的盆神经节组织内观察到血管存在，“细胞团”样结构仍较明显。此外，移植后4周，移植到Nu/Nu裸鼠肾被膜下的海绵体组织和盆神经节中可见ki67阳性的细胞存在，提示移植物内部分细胞仍存在增殖活性。结论：将正常SD大鼠阴茎海绵体组织和盆神经节移植到裸鼠肾被膜下后，至少可以存活4周，移植物内部组织结构与正常SD大鼠阴茎海绵体和盆神经节组织结构基本一致，可能与肾被膜下提供了移植物所需的局部微环境及移植物内部逐渐形成血液循环有关。

肾被膜；阴茎海绵体；盆神经节；移植，异体；小鼠，裸

糖尿病“代谢记忆”现象可能在糖尿病相关阴茎勃起功能障碍(erectiledysfunction,ED)的发生、发展中发挥重要作用[1]，但是，无论在临床实践还是基础研究中，均很难将糖尿病后出现的高血糖持续控制在正常范围内，因此，建立一种能使糖尿病病变组织存活的正常血糖环境，是研究糖尿病“代谢记忆”引起糖尿病相关合并症及组织病理变化的重要基础。另外，在基于ED动物模型的研究中，发现治疗干预后阴茎组织内标记滞留细胞数量迅速增加，提示低能量冲击波可能通过调节内源性干细胞/前体细胞发挥ED治疗作用[2-4]，但是，ED治疗后局部增多的内源性干细胞来源为何(可能来源于阴茎自身、邻近器官或骨髓)， 仍不得而知。

本研究拟将正常阴茎海绵体组织及盆神经节(majorpelvicganglion,MPG)移植到免疫缺陷小鼠肾被膜下，探索活体组织异体移植的可行性。一方面，该技术可使糖尿病病变阴茎海绵体组织和盆神经节彻底脱离糖尿病的病理微环境，将来可用于研究“代谢记忆”现象在糖尿病相关ED发生、发展中的作用机制；另一方面，该技术还可用于研究ED治疗后阴茎局部增多的内源性干细胞的组织来源问题。

1　材料与方法

1.1实验动物和仪器

雄性Nu/Nu裸鼠， 32只，3月龄；正常SD(Sprague-Dawley)大鼠， 32只，3月龄，购买自北京维通利华实验动物科技有限公司。手术显微镜和光学显微镜均购自德国Leica公司。50g/L戊巴比妥钠由北京大学第一医院动物实验中心提供。ki67抗体购买自美国Abcam公司。

1.2操作过程

SD大鼠和Nu/Nu裸鼠腹腔注射50g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉后，将SD大鼠仰卧位固定于手术小桌板，会阴部碘伏消毒，无菌条件下切取阴茎海绵体和MPG，分别放到两个含有4mL无菌磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)培养皿中。移植前取阴茎海绵体中间部位进行切片，切片厚度1.0～1.5mm。

Nu/Nu裸鼠麻醉后，俯卧位固定于手术小桌板，碘伏消毒后铺无菌洞巾。于脊柱两侧肋缘下沿肋骨走行方向做1cm切口，将肾从手术切口轻轻挤出。沿肾纵轴用显微外科手术器械角膜剪将肾被膜打开，切口长度0.5cm,然后，将来源于同一只SD大鼠的阴茎海绵体切片(2片)和MPG(2个)分别移植于同一只Nu/Nu裸鼠的左侧和右侧肾包膜下(图1)。分别于移植后1周和4周完整获取带有移植物的裸鼠肾，行HE(hematoxylineosin)染色和免疫组织化学染色。

A, open the kidney capsule; B, the graft was transplanted underneath the kidney capsule.
图1Nu/Nu裸鼠肾被膜下移植(以阴茎海绵体组织移植为例)
Figure 1Implantation under the renal subcapsular space of Nu/Nu mice (in the case of penile tissue transplantation)

1.3组织病理学染色

标本经组织固定液[2%(体积分数)甲醛+0.002%(体积分数)饱和苦味酸]固定4h，浸入300g/L蔗糖溶液过夜。梯度乙醇进行组织脱水，二甲苯透明，浸蜡。组织切片厚度4μm，将切片浸入二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化切片。HE染色：浸入苏木精染色3min，水洗，1%(体积分数)盐酸乙醇分化，氨水返蓝，最后浸入伊红染色1min，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树脂封片。免疫组织化学染色以anti-ki67(1 ∶400)为一抗。

2　结果

2.1移植物组织学形态

移植后1周，阴茎海绵体组织存活良好，HE染色显示其组织形态与正常阴茎海绵体组织一致；移植4周后，靠近肾的阴茎海绵体组织形态接近正常，而远离肾组织的阴茎海绵体组织出现较明显的纤维化，成纤维细胞增殖明显，在组织形态变化明显的交界部位，有大量血管样结构生成 (图2)。

A, C, 1 week after transplantation; B, D, 4 weeks after transplantation. a, corpus cavernosum close to the kidney; b, corpus cavernosum away from the kidney; A, B ×100; C, D ×400.
图2阴茎海绵体移植后HE染色检测组织病理学变化
Figure 2Histopathologic changes of transplanted corpus cavernosum with HE staining

MPG移植后1周，其组织形态与正常MPG相近，内部见多个“细胞团”样结构，在靠近肾部位有新生血管样结构形成；移植后4周，仍可在移植物内观察到正常MPG内典型的“细胞团”样结构，并可在远离肾的部位观察到血管存在(图3)。

A, C, 1 week after transplantation; B, D, 4 weeks after transplantation. MPG, major pelvic ganglion; A, B ×100; C, D ×400.
图3MPG移植后HE染色检测组织病理学变化
Figure 3Histopathologic changes of transplanted MPG with HE staining

2.2移植物内细胞增殖观察

移植后4 周，在阴茎海绵体组织和MPG内均可见ki67阳性细胞存在，提示移植物组织内细胞存活并存在增殖活性(图4)。

3　讨论

糖尿病对人体健康的危害主要由各种合并症引起，包括ED、糖尿病眼底病变、糖尿病肾病等。自20世纪80年代开始，研究者逐渐意识到部分糖尿病患者在控制血糖后仍不能阻断糖尿病合并症的发生和发展，由此提出糖尿病“代谢记忆”的概念[5-6]。目前，糖尿病代谢记忆的相关研究主要集中在终末糖基化代谢产物(advancedglycationendproducts，AGEs)、氧化应激(reactiveoxygenspecies,ROS)及表观遗传学改变等方面[7]。一般认为，糖尿病发生后组织内产生的AGEs具有不可逆性，即便高血糖被纠正也不能完全清除AGEs，而AGEs积累到一定程度后会通过相关机制引发后续脏器损伤[8]。在临床实践和基础研究中，单纯通过药物将糖尿病患者或动物模型的血糖持续控制在正常范围内是比较困难的，因此，药物纠正高血糖后仍然出现的糖尿病“代谢记忆”现象，是由AGEs不可逆性引起的还是由间断出现的异常血糖引起的仍不得而知。基于上述考虑，如果把糖尿病病变组织转移到一种完全不受高血糖影响的环境中，将会进一步明确AGEs与糖尿病组织病理变化之间的关系。

A, penile tissue transplantation; B, major pelvic ganglion tissue transplantation. MPG, major pelvic ganglion.
图4免疫组织化学染色检测移植物内细胞存活及增殖活性，黑色箭头示ki67阳性细胞(×200)
Figure 4Cell proliferation and survival in the transplants with immunohistochemical staining, black arrows indicate the ki67 positive cells (×200)

另外，干细胞(内源性干细胞)存在于机体各组织、器官内，正常状态下处于静息和自我更新的动态平衡中，对于组织稳态和损伤后修复具有重要作用[9]。值得注意的是，发挥修复作用的干细胞，除来源于组织局部，还可能来源于邻近器官、骨髓或血液等部位[10]。由于缺乏特定组织内干细胞有效的标记技术，很难对损伤部位干细胞的来源进行鉴定。但是，通过异体移植模型，有望对拟研究的干细胞其来源组织和受损部位之间的关系进行研究。目前，肾被膜下组织移植技术主要用于肿瘤研究领域，用于肿瘤对药物敏感性测定等，此外，还有文献报道将胰岛细胞[11]和睾丸细胞[12]移植到肾被膜下以进行相关研究，其原理主要是根据肾被膜下血管丰富，可提供移植物存活所必须的氧和营养物质。本研究将阴茎海绵体和MPG移植到Nu/Nu裸鼠肾被膜下，发现移植物在裸鼠体内存活良好，能基本保持原有的组织形态，且组织内细胞能保持一定的增殖活性。

将来研究中，利用该技术将糖尿病病变阴茎组织和盆神经节移植到Nu/Nu裸鼠肾包被下，有望明确“代谢记忆”现象在糖尿病相关ED发生、发展中的作用机制。此外，将感兴趣的其它脏器组织移植到Nu/Nu裸鼠肾包膜下，并建立Nu/Nu裸鼠ED动物模型，有望明确ED治疗后阴茎局部增多的内源性干细胞的组织来源问题。

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(2016-05-17 收稿)

(本文编辑：刘淑萍)

Feasibilitystudyoftransplantationofpenilecorpuscavernosumandmajorpelvicganglioninrenalsubserousregion

XUYong-de1,2,GUANRui-li1,WUYuan-yi3,LEIHong-en1,YANGBi-cheng1,LIHui-xi1,WANGLin1,GUOYing-lu1,XINZhong-cheng1△

(1.AndrologyCenter，PekingUniversityFirstHospital，Beijing100034，China; 2.InstituteofBasicMedicalScience,ChinesePeople’sLiberationArmyGeneralHospital,Beijing100853,China; 3.DepartmentofUrology,FirstHospitalAffiliatedtoChinesePeople’sLiberationArmyGeneralHospital,Beijing100037,China)

Objective：Tostudythefeasibilityoftransplantationofnormalratpenilecorpuscavernosumandmajorpelvicganglion(MPG)intotherenalsubserousregionofaNu/Numousebasedonallografttechnology.Methods:PenilecorpuscavernosumandMPG,harvestedfromSprague-Dawley(SD)ratsundersterilecondition,weretransplantedunderneaththekidneycapsuleofNu/Numicethroughthemicrosurgeryinstrumentsandsurgerymicroscope.ThehistopathologicchangesandcellularproliferationinthetransplantedpenilecorpuscavernosumandMPGwerethenanalyzedattheendof1weekand4weeksaftertransplantation.Histologicalstainingandimmunohistochemicalstainingwereusedtoevaluatethemainoutcomemeasures.Results:After1week,thetissuemorphologyofthetransplantedcorpuscavernosumunderneaththekidneycapsuleofNu/Numicewasconsistentwithnormalpenilecorpuscavernosum,andbloodcouldbeobservedinthepeniscavernoussinusofthegraft;after4weeks,themophorlogyofthetranplantedcorpuscavernosumnearthekidneywasconsistentwithnormalpenilecorpuscavernosum,whilefibrosiswasnoteworthyinthegraftawayfromthekidney,butbloodcouldstillbeseeninthepeniscavernoussinus.After1week,thetissuemorphologyofthetransplantedMPGwasconsistentwithnormalMPG,multipleislet-likecellclusterscouldbeseeninthetransplantedMPGintherenalsubserousregion,andangiogenesiscouldbeobservednearthekidney;after4weeks,anetworkofbloodvesselswasclearlyvisibleawayfromthekidney,andislet-likecellclusterswerestillclearlyobservedinthetransplantedMPG.Inaddition,ki67positivecellswereobservedinthetransplantedpenilecorpuscavernosumandMPGafter4weeksoftransplantation,whichindicatedthattherewasstillcellproliferationactivityinthegrafts.Conclusion:ThetransplantedcorpuscavernosumandMPGunderneaththekidneycapsuleofNu/Numicecouldsurviveatleast4weeks.Moreover,theinnerstructureofthetransplantedcorpusca-vernosumandMPGwasclosetothenormaltissue.TheunderliningmechanismmayberelatedtothelocalmicroenvironmentunderneaththekidneycapsuleofNu/Numiceandtheneovascularizationinthetransplantedgrafts.

Renalcapsule;Penilecorpuscavernosum;Pelvicganglia;Transplantation,allogeneic;Mouse,nude

国家自然科学基金(81270693)和高等学校博士学科点专项科研基金(20120001110021)资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(81270693)andSpecialScientificResearchFoundationforDoctoralDisciplineAreaoftheInstitutionofHigherLearning(20120001110021)

R698.1

A

1671-167X(2016)04-0725-04

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.031

△Correspondingauthor’se-mail,xinzc@bjmu.edu.cn

网络出版时间：2016-6-2210：10：02网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160622.1010.010.html