高通量转录组测序技术研究过表达GPC5对A549细胞基因表达影响

张海天 王国祥 杨欣 邱满堂 许林

本课题组在前期研究中发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5（glypican-5, GPC5）在非小细胞肺癌中扮演着抑癌基因的角色，且GPC5在非小细胞肺癌组织中显著低表达，而过表达GPC5可以显著抑制肺癌细胞的侵袭和迁移能力[1]。此后，陆续有研究[2,3]报道GPC5在肺癌中低表达且具有抑癌基因样作用。

目前的研究多认为GPC5是一个转移抑制因子，而GPC5对细胞增殖影响的研究较少；此外，GPC5的具体分子生物学机制尚未明确。因此，在本研究中我们构建了稳定高表达GPC5的肺腺癌A549细胞株，通过细胞生物学实验和高通量转录组测序手段来研究GPC5对肺腺癌细胞增殖能力和基因表达的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海细胞库；慢病毒载体及稳定转染细胞株由上海吉凯生物公司完成；RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司。1640培养基和胎牛血清购于Gibco公司，Cell Counter Kit8（CCK8）和EdU试剂盒购于南京凯基生物公司。

1.2 细胞培养 肺腺癌细胞株A549在含10%FBS的1640培养液中，37oC、5%CO2保持饱和湿度培养，2天-3天传代一次[4]。

1.3 CCK8实验 将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔接种3,000个细胞，每组设置5个复孔；分别在接种细胞贴壁后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h吸去培养基，每孔加入100 μL培养液和10 μL CCK8试剂，孵育2 h后使用自动酶标仪检测450 nm波长处吸光值[5]。

1.4 平板克隆实验 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔接种200个细胞，每4天换液一次。2周后吸去培养基，使用甲醇将细胞克隆固定，然后用结晶紫染液染色，计数每个孔中克隆形成数目并拍照。

1.5 EdU实验 将处于对数生长期的细胞均匀接种与盖玻片上，待细胞贴壁后使用凯基EdU试剂盒进行染色固定并拍照。

1.6 转录组测序 GPC5稳定转染和空白对照的A549细胞由Trizol法提取RNA，转录组测序及数据分析由上海烈冰生物有限公司完成。

1.7 统计学方法 所用统计分析使用SPSS 18.0统计软件完成。两个样本均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图 1 相对于空白载体组，过表达GPC5显著抑制了A549细胞的增殖速率（A），克隆形成数目也显著减少（181±17 vs 278±23）（B）。EV：空载体组；GPC5：过表达GPC5组；*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 1 Compared with empty vector, overexpression of GPC5 significantly inhibited cell proliferation rate (A) and colony formation number (B). EV: empty vector; GPC5: overexpression of GPC5; *P＜0.05,**P＜0.01.

2 结果

2.1 过表达GPC5抑制A549细胞增殖速率和克隆形成能力相对于空白载体组，CCK8结果提示稳定过表达GPC5后，A549细胞的增殖速率被显著抑制，且以接种后第三天后抑制效果最明显（图1A）。在平板克隆形成实验中，过表达GPC5后A549细胞形成的克隆数目显著少于空白载体组（181±17vs278±23，图1B），且具有统计学差异。

图 2 相对于空白载体组，过表达GPC5组阳性细胞比例显著降低。EV：空载体组；GPC5：过表达GPC5组。Fig 2 Compared with empty vector, overexpression of GPC5 decreased the percentage of positive staining cells. EV: empty vector; GPC5: overexpression of GPC5.

图 3 过表达GPC5后，47个具有正性调节细胞增殖功能的基因显著下调。EV：空载体组；GPC5：过表达GPC5组；绿色：下调基因；红色：上调基因。Fig 3 Compared with empty vector, 47 genes of Gene Ontology item “positive regulation of cell proliferation”were downregulated. EV: empty vector, GPC5:overexpression of GPC5; green: downregulated genes;red: upregulated genes.

2.2 过表达GPC5抑制A549细胞增殖能力 如图2所示，稳定转染GPC5之后，EdU染色阳性的细胞比例显著低于空白载体组。CCK8、平板克隆形成和EdU结果证实：过表达GPC5可以抑制肺腺癌细胞A549的增殖能力。

2.3 过表达GPC5抑制增殖相关基因表达 为了研究过表达GPC5对A549细胞基因表达变化影响，我们将稳定转染GPC5和空白载体组的A549进行了高通量转录组测序。转录组测序结果显示，稳定转染GPC5之后有876个基因表达显著升高，而1,232个基因表达显著降低。对下调基因进行基因本体论（gene ontology, GO）分析发现具有“positive regulation of cell proliferation”功能的47个基因被显著富集（图3和表1）。转录组测序和GO分析结果提示过表达GPC5可以下调具有正性调节细胞增殖功能基因的表达，进而抑制细胞增殖能力。

表 1 47个具有正性调节细胞增殖功能的基因Tab 1 47 downregulated genes of Gene Ontology item “positive regulation of cell proliferation”

3 讨论

GPC5是一种细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖，GPC5可以通过糖基-磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面。GPC5基因属于磷脂酰肌醇蛋白聚糖（heparan sulphate proteoglycans, HSPGs）家族，该家族有6个成员，分别为GPC1到GPC6[6,7]。HSPGs家族成员与多种肿瘤发生进展相关，如GPC3在肝癌中显著高表达[8]，而GPC1可以抑制胰腺癌细胞增殖[9]。而目前对于GPC5与肿瘤的报道相对较少，对于GPC5发挥抑癌作用的分子生物学机制尚不清楚。

本课题组已报道在肺癌细胞中，过表达GPC5可以显著抑制SK-MES1细胞的侵袭、迁移能力，在本研究中我们进一步在肺腺癌细胞A549中探讨GPC5对细胞增殖能力和基因表达的影响。通过CCK8、平板克隆和EdU实验，我们证实了过表达GPC5可以显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖能力。进一步对细胞进行高通量转录组测序发现，相对于空白载体组，过表达GPC5后，2,108个基因的表达发生显著变化。进一步分析发现过表达GPC5之后，具有正性调节细胞增殖的基因显著下调，例如CXCL5[12]、SOX4[11,12]。作为一个细胞膜蛋白，Li等[6]曾推测GPC5可能通过刺激或者抑制下游的信号转导通路来调控基因表达，如通过Wnt、hedgehog和FGF信号通路。本研究发现过表达GPC5可以导致众多基因表达发生显著变化，而其中的具体分子生物学机制还需进一步研究。

本研究结果证实过表达GPC5可以显著抑制肺腺癌细胞的增殖能力，而且过表达GPC5后具有正性调节细胞增殖作用的基因表达下调，具体的信号通路机制还需进一步实验验证。