胶体金免疫层析技术在水产品药物残留检测中的应用进展

赵彦华，刘洪岩，丁正峰，孙梦玲，薛晖（江苏省淡水水产研究所，江苏　南京　210017）

胶体金免疫层析技术在水产品药物残留检测中的应用进展

赵彦华，刘洪岩，丁正峰，孙梦玲，薛晖
（江苏省淡水水产研究所，江苏南京210017）

摘要：胶体金免疫层析技术作为一种新型的检测技术，在实际应用中具有简单、快速、成本低廉等优点，因而广泛应用于生物学领域，本文就胶体金免疫层析技术的应用原理以及在水产品药物残留的应用进展作简要概述。

关键词：胶体金免疫层析技术；水产品；药物残留检测

近年来，随着人们对食品质量安全的重视以及贸易出口的需要，水产品中药物残留问题也越来越受人们的重视。大量抗菌药物的使用，导致动物性食品中药物残留状况较为严重，对人类的健康构成了潜在的危害。然而常规的检测方法对仪器设备、环境、操作技能等有很高的要求，而且具有检测周期较长、价格昂贵等缺点，因此建立一种新型快速稳定的检测方法是十分必要的［1］。胶体金免疫层析技术是以固相膜为载体的一种新型的快速检测技术，具有快速、简单、成本低廉等优点，因而自20世纪80年代发展至今，已经在生物医药领域中得到了迅速广泛的应用［2］，本文针对胶体金免疫层析技术的原理以及在水产品药物残留检测中的应用进展做一简要概述。

1　胶体金免疫层析技术的简介

1.1胶体金免疫层析技术的原理

胶体金免疫层析技术（Gold immunochromatography assay GICA）是集金标技术、检测技术和层析技术于一体的固相标记免疫检测技术。基础的晶核（原子金Au，由11个金原子形成的二十面体）和外层的双离子层构成胶体金粒子，而胶体金粒子则是构成胶体金溶液的主要物质。金颗粒在氯金酸（HAuCl4）还原剂的作用下形成颗粒状，并且以一种疏水的胶状形式存在，在金粒子表面存在着一层阴性电荷，胶体金颗粒互相排斥，在静电作用下形成稳定的胶体状态从而使悬浮液保持稳定［3］。胶体金粒子对蛋白质具有很强的吸附性，可以与多种免疫球蛋白共价结合，并且在金颗粒聚集的地方肉眼可直接观察到粉红色斑点，因而可用于定性或半定量实验。

胶体金免疫层析技术是以固相膜为载体的胶体金技术与层析技术结合起来的一项新的检测技术，将已知的抗原或者抗体吸附于固相膜上，在固相膜的结合释放垫上吸附胶体金颗粒标记物，其两端分别与样品垫和固相膜相连；待检样品在毛细作用下会向前移动，当移动到金标颗粒标记物处时，就能吸附上标记物，继续移动至相应检测线并出现肉眼可见的颜色变化，从而来判断结果。

1.2胶体金粒子的特性

胶体金粒子具有两大类特性。一类特性是具有很强的吸附作用，尤其是对蛋白质，可以与多种免疫球蛋白、酶、牛血清白蛋白、葡萄球菌蛋白等多肽非共价结合，因而可以作为一种工具用于实验室研究［4］。胶体金颗粒的表面吸附蛋白质即胶体金标记的过程，胶体金颗粒和蛋白质之间的结合过程主要是依靠一些疏水作用力、离子键或者是配位键来实现。其中疏水作用力主要是蛋白质依靠疏水作用力吸附于金颗粒表面；离子键主要是正负电荷之间的反应；配位键是氨基酸的硫残基与金颗粒发生电子层配位［5］。

胶体金颗粒的另一个重要的特性就是在金标蛋白结合处可以肉眼观察到颜色变化，可以用于定性或者半定量的快速检测中［6］。由于标记物在相应配体处大量聚集存在，因而金标颗粒聚集处会出现粉色或者是红色斑点，在显微镜下尤为明显，可以观察到黑褐色颗粒的存在。

1.3胶体金免疫层析技术反应方法

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性［7］。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。常用的胶体金免疫层析技术反应方法包括竞争法、捕获法以及夹心法，根据检测物质的分子量大小来选用不同的技术反应方法，从而达到最好的检测效果。

1.3.1竞争法用于检测小分子抗原，具有灵敏度高、反应迅速、不易形成交叉反应等特点。在水产品药物残留检测中主要应用于喹诺酮类的检测［8］。

1.3.2捕获法捕获法在水产品药物残留检测中的应用较少，但是可应用于鱼类疾病的诊断，主要检测病原微生物产生的特异性抗体，对于标本较难采集的病原体，也可采用此方法检测［9］。

1.3.3夹心法夹心法主要是用于检测大分子抗原物质，有双抗原夹心法和双抗体夹心法两种方式。双抗原夹心法主要用于检测抗体，标记和包被均采用抗原。双抗体夹心法则主要用于检测颗粒性大分子抗原物质。

2　胶体金免疫层析技术在水产品药物残留检测中的优势

目前检测水产品中的药物残留最常见的检测方法是利用仪器进行分析，主要是色谱法，包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）以及色谱质谱（GC-MS）联用技术等［10］。

气相色谱法是定量测定氯霉素较为经典的方法，也是我国商检定量分析氯霉素残留首选方法［11］。但气相色谱法前处理过程复杂，衍生化过程较为繁琐耗时，从而使得该方法具有一定的局限性。色谱质谱联用技术虽然具有较高的灵敏度和准确度，但是不适用于养殖用户、生产加工企业及基层检测单位的推广应用［12］。

相比传统的检测方法，应用胶体金免疫层析技术检测水产品中药物残留，具有以下优势：①样品不必进行处理，可直接检测组织液或者血液。②不需要操作大型的仪器设备，大大简便了操作，对实验人员的技能要求较低，更适用于野外现场应用。③试剂用量少，试纸条体积小，携带方便，无污染，可以用于大批量样品的现场检测。④准确度和灵敏度均较高，假阳性率较低，结果判断简单，能够快速准确的反应样品中药物残留的情况。⑤检测时间较短，一般5～10 min就可以目测结果，并且检测结果可以长期保存。

3　胶体金免疫层析技术在水产品药物残留检测中的应用

胶体金免疫层析技术需要免疫学原理才可以检测，这样可以提高对药物的识别性从而对组织细胞内的微型药物都有着非常高的敏感性［13］。胶体金免疫检测技术具有迅速准确的特点，因而其在水产品药物残留检测上的应用非常广。国内许多科研工作者已着手研究胶体金免疫层析法用于水产品中禁限用渔药、激素、重金属、微生物等快速检测技术，为该技术的成果转化做好科研储备［14］。

目前，氯霉素、孔雀石绿和硝基呋喃类药物在水产品中残留最为严重，属于必检项目［15］。这些药物简单且廉价易得，因而在水产品养殖中使用较广，在动物体内代谢时间较长，能够不同程度的在水产品中蓄积，最后通过食物链的作用危害人体健康，主要表现为致癌、致畸、致突变等作用。社会各界研究者建立了诸多方法用于更简便快捷的检测这些药物残留，尤其以胶体金免疫层析技术在这些药物残留检测中的研究进展较多。

3.1胶体金免疫层析技术在氯霉素检测中的应用

氯霉素作为广谱抗生素，在水产养殖疾病预防和治疗中具有明显的效果。但是氯霉素在水产品体内有明显的残留现象，残留期长，通过食物链进入人体，对人体产生严重危害［16］。因此，国内外均制定了一系列的法律法规禁止氯霉素的使用，我国农业部也规定在动物性食品中不得检出氯霉素。

李余动等［17］在2005年建立了氯霉素胶体金免疫层析试纸条，检测虾肉样品时，灵敏度可达到1 ng/mL，无交叉反应。桑丽雅等［18］在2013年研制了氯霉素快速检测胶体金试剂条，该试剂条对水产品中氯霉素的检测限为0.3 μg/kg，假阳性率4%，假阴性率为2%，常温保质期在6个月以上。杨挺等［19］根据竞争式胶体金免疫层析试验原理，研制了氯霉素检测免疫试纸条，该金标试纸条对虾肉样品中的氯霉素最低检出限为1.5 μg/kg。王玮［20］利用胶体金标记快速检测技术对氯霉素兽药残留快速检测方法进行了系统的研究，建立了以氯霉素与固相膜上的氯霉素-卵清蛋白（CAP-OVA）偶联物（即包被抗原）竞争结合金标记抗氯霉素多克隆抗体的方法，利用胶体金显色的特点最后达到快速检测样品中氯霉素残留的目的。

3.2胶体金免疫层析技术在孔雀石绿检测中的应用

孔雀石绿属于一种三苯甲烷类杀菌剂，具有高效和价格低廉的特点，因而在水产养殖疾病防治中被广泛应用。然而孔雀石绿及其代谢物都具有高残留性和高毒性，不仅仅造成了水产品的畸变和癌变，也给食用者的健康带来了潜在的风险［21］。

桑丽雅等［22］运用免疫胶体金快速层析技术对水产品中孔雀石绿及其代谢物残留进行快速筛选，最低检出限分别为l μg/kg和3 μg/kg，但是检测时间较长，约为30 min。山珊等［23］基于竞争抑制反应原理，制备出了孔雀石绿胶体金免疫层析试纸条，建立孔雀石绿免疫层析定量检测方法，检测灵敏度为3 μg/L。

3.3胶体金免疫层析技术在呋喃唑酮代谢物检测中的应用

硝基呋喃类药物在动物体内代谢形成的代谢物，能够与蛋白质结合形成蛋白结合物，该类结合物在弱酸条件下能够分解并被人体吸收，对人体健康产生极大的影响。对中国渔业产业发展造成巨大影响之一的“多宝鱼事件”便是因硝基呋喃代谢物残留引起的。

2004年，Kevin等首先制备出了呋喃唑酮衍生物的多克隆抗体，为呋喃唑酮代谢物的免疫分析方法奠定了基础。2013年刘欢等［24］基于免疫胶体金技术，建立了水产品中硝基呋喃类代谢物残留快速检测和评价系统。张敏、桑丽雅等［25］研制了用于检测水产品中硝基呋喃代谢物的胶体金快速检测试剂板，该试剂板为四合一试剂板，对水产品中呋喃唑酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物的检出限分别为 1.0、1.0、1.0、2.0 μg/kg。结果表明该试剂板具有快速、准确、灵敏度高的特点，适用于大批量水产样品中硝基呋喃代谢物的检测。

在中国，水产品养殖的模式主要以个体养殖为主，养殖户多又分散，就造成了个别养殖户在生产过程中使用违禁药物。水产品质量检测是水产品质量管理、衡量水产品质量安全水平的首要手段，具有非常重要的现实意义［26］。近年来，随着食品安全体系的健全和发展，面对多而散的庞大监管对象，如何实现安全、快速、高效的检测，成为食品检测中的热点问题。尤其针对中国水产品胶体金免疫层析技术作为一种新兴技术，具有实验室传统检测方法所不具有的优势，能够缩短实验室检测时间、成本低廉、及时准确并且可用于大批量的现场检测等特点，从而在生物医学、临床检测、微生物检测以及药物残留检测中有广泛的应用。

4　小结

目前，国内许多科研工作者已着力研究胶体金免疫层析法在水产品药物残留中的应用，使得这项技术的实际应用价值更高。由于这项技术属于新兴技术，虽然许多生物技术公司也已经开发了相应的产品，但是成品化的产品有限，产品成果较少，随着科学技术的发展，这项技术将会逐步成熟和完善，其在水产品检测中具有很好的应用前景。

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资助项目：江苏省水产三项工程（D2013-52）

中图分类号：Q176

文献标志码：A

文章编号：1004-2091（2016）07-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.07.001

收稿日期：（2015-11-18）

作者简介：赵彦华（1986-），女，研究实习员，主要从事水产病害研究.E-mail:njzhaoyanhua@163.com

通信作者：薛晖（1968-），男，硕士，研究员级高级工程师，主要从事水产病害研究.E-mail:jsxuehui@163.com

Colloidal Gold Immunochromatographic Assay（GICA）for detection of drug residues in aquatic products

Zhao Yanhua，Liu Hongyan，Ding Zhengfeng，Sun Mengling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Abstract：Colloidal Gold Immunochromatographic Assay（GICA）is a new detecting technology，and it is convenient，rapid and inexpensive.GICA has been widely studied and used in biology areas.Principle，applications as well as development prospect of GICA in detection of drug residues in aquatic products were summarized in this paper.

Key words：Colloidal Gold Immunochromatographic Assay（GICA）；aquatic product；drug reseidues detection