上调miR-200c表达对人肝癌干细胞化疗耐药性的影响

丁　红，千年松，杨　凡，张鹏飞，王艳荣，戴广海

(1.解放军总医院，北京 100853；2.第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032)



上调miR-200c表达对人肝癌干细胞化疗耐药性的影响

丁红1，千年松1，杨凡2，张鹏飞1，王艳荣1，戴广海1

(1.解放军总医院，北京 100853；2.第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032)

目的观察人肝癌干细胞中miR-200c的表达改变对化疗药物敏感性的影响。方法利用流式细胞分选技术从MHCC97人肝癌细胞系中分离出肝癌干细胞。应用脂质体介导转染miR-200c mimics到肝癌干细胞；采用实时荧光定量RT-PCR对转染miR-200c mimics前后肝癌干细胞中miR-200c表达水平进行检测；通过噻唑蓝(MTT)法检测miR-200c对肝癌干细胞药物敏感性的影响。结果肝癌干细胞中miR-200c的相对表达量为0.17±0.02，转染miR-200c mimics后肝癌干细胞中miR-200c的相对表达量为1.24±0.28，转染前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。转染前5-氟尿嘧啶 (5-Fu)和阿霉素(ADM)对肝癌干细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为22.74 mg/L和9.56 mg/L，转染miR-200c mimics后5-Fu和ADM对肝癌干细胞的IC50分别为12.63 mg/L和3.51 mg/L，转染前后比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论上调人肝癌干细胞中miR-200c的表达可以增强肝癌干细胞的化疗敏感性，具有逆转其化疗耐药的作用。

肝癌；肿瘤干细胞；miR-200c；化疗耐药性

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)学说认为，肿瘤干细胞自身所具有的多药耐药特性是导致恶性肿瘤对化疗药物治疗敏感性降低，并引起肿瘤复发甚至转移的“罪魁祸首”[1-2]。microRNA(miRNA)为在真核细胞生物体中广泛存在的非编码小分子单链RNA，其能够调控肿瘤细胞中多个耐药基因的表达，因而其参与肿瘤多药耐药性的具体机制也成为目前肿瘤治疗领域的研究热点[3]。miR-200c是近年来发现的一个与肿瘤形成、肿瘤进展和化疗耐药有关的miRNA[4]。然而miR-200c是否参与调控肝癌干细胞的化疗耐药性，目前尚未见相关研究报道。本研究从肝癌细胞中分选出肝癌干细胞，通过转染miR-200c mimics上调肝癌干细胞miR-200c的表达，观察miR-200c对肝癌干细胞耐药性的影响，现将结果报道如下。

1　实验资料

1.1主要材料与试剂人肝癌细胞MHCC97购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和荧光染料Hoechst33342购自Sigma公司；DMEM F12培养基、小牛血清购于Gibco公司；TaqMan MicroRNA Assay、mirVana RNA Isolation Kit和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit购自美国Ambion公司；Prism®7300实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。miR-200c、U6引物及miR-200c mimics购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养将MHCC97细胞接种于DMEM F12 培养液(10%小牛血清+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL链霉素)中，放入细胞培养箱中于37 ℃、5% CO2条件下培养；0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2肝癌干细胞的分选将MHCC97细胞制成单细胞悬液并调整细胞密度为1×109L-1，分为2组，分别加入荧光染料Hoechst33342和维拉帕米至终浓度分别为6 mg/L和50 mmol/L。在Advantage II型流式细胞仪上，选择355 nmUV激光发射源进行检测，根据细胞二维散点图形态及参数分选出边缘群细胞即为肝癌干细胞。

1.2.3细胞转染将分选后的肝癌干细胞接种于6孔板中，培养24 h(细胞融合度达60%左右)后，按脂质体Lipofectamine2000说明进行SP细胞miR-200c mimics的转染。待细胞转染48 h后采用RT-PCR检测细胞miR-200c表达水平。miR-200c mimics序列： 5’-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGA-3’。

1.2.4实时荧光定量RT-PCR检测转染48 h采用mirVana RNA Isolation Kit和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit并按说明进行细胞总RNA及miRNA的提取。逆转录反应体系：1×mirVanaRT Primer 1 μL，mirVana5×RT Buffer 2 μL，Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL，25 ng RNA，加无RNA酶水至总体积10 μL。PCR扩增体系：Taqman MicroRNA Assay(20×) 1 μL，Product from RT reaction 1.33 μL，Taqman 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，加无RNA酶水7.67 μL至总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s共40个PCR循环。RT- PCR数据结果采用2-ΔΔCT法进行分析。U6 snRNA引物序列：上游为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-200c引物序列：上游为5’-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3’，下游为5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。

1.2.5MTT实验将分选后的肝癌干细胞按5×104/孔接种于96孔板中，每孔100 μL。细胞培养箱中培养24 h后，分为5-氟尿嘧啶 (5-Fu)组、阿霉素(ADM)组和空白对照组。配制不同浓度的含5-Fu和ADM化疗药物的细胞培养基，然后每孔分别加入相应培养基100 μL，每个药物不同浓度分别设置6个复孔；同时设置无药物干预的细胞对照组和无细胞的空白对照组。继续孵育细胞24 h 后，加入20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h后去除培养基，每个培养孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡反应10 min。置于全自动酶标仪中，设定波长为490 nm，读取各孔吸光度(A)值，重复3次，计算半数抑制剂量(IC50)。

2　结　　果

2.1肝癌干细胞分选情况利用流式细胞分选技术分离纯化肝癌干细胞，流式细胞仪二维参数图左下角两种荧光均阴性或很弱的区域即为肝癌干细胞，结果显示肝癌干细胞约占肝癌细胞总数的1.94%。

2.2转染miR-200c mimics前后肝癌干细胞miR-200c表达量转染前，肝癌干细胞中miR-200c的相对表达量为0.17±0.02，转染miR-200c mimics后肝癌干细胞中miR-200c的相对表达量为1.24±0.28，转染前后比较差异有统计学意义 (P<0.05)。

2.3转染miR-200c mimics前后肝癌干细胞耐药性情况转染前5-Fu和ADM对肝癌干细胞的 IC50分别为22.74 mg/L和9.56 mg/L，转染miR-200c mimics后5-Fu和ADM对肝癌干细胞的IC50分别为12.63 mg/L和3.51 mg/L，转染前后比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，提示增强肝癌干细胞miR-200c的表达能够增加肝癌干细胞对化疗药物的敏感性。

3　讨　　论

miRNA是广泛存在于真核细胞生物体中的具有高度保守序列的小RNA。其作用机制主要在于抑制靶基因的翻译或直接降解靶基因mRNA。目前的研究证实，miRNA可以调节约30%人类基因的表达和翻译[5]。尤其值得关注的是，研究人员在miRNA研究过程中发现miRNA能够通过调控耐药相关相关靶基因的表达，进而影响其信号通路，从而导致肿瘤细胞的耐药性发生改变。如miR-328作用于转运蛋白ABCG2的3’-UTRs，通过抑制ABGG2的表达来提高肿瘤细胞的化疗敏感性[6]；miR-125b通过调控肿瘤耐药基因Bcl-2 和ABCC4的表达来影响肿瘤细胞的耐药性[7]。由于miRNA在调控肿瘤细胞耐药性上的作用至关重要，且miRNA具有内源性和调控多个下游靶基因表达的特性，因而，通过调控肿瘤细胞中相关耐药miRNAs的表达，理论上具有比调控单个普通耐药基因具有更好的效能。

随着肿瘤领域中干细胞机制相关研究的不断深入，CSCs是肿瘤形成和进展的始作俑者这个观点已得到医学界的广泛认同。大量的研究证实，CSCs具有天然耐药性是导致目前化疗药物治疗肿瘤失败的关键所在[8]。CSCs对化疗药物产生耐药性的相关机制十分复杂，尚待进一步研究。目前已知与其肿瘤细胞膜表达ABC转运蛋白、增强的抗DNA损伤及修复能力、抗凋亡基因表达增强等机制有关[9-10]。虽然随着临床上新型化疗药物的不断研发和应用，能够很大程度上杀死肿瘤细胞。但是由于CSCs具有的天然耐药性使其很难被化疗药物完全消灭，残存的CSCs则会导致化疗后肿瘤复发[11]。因此，针对CSC的化疗耐药特性机制进行靶向性的研究对于提高化疗效果至关重要。本次研究采用流式荧光分选技术这一目前公认的肿瘤干细胞分选技术从肝癌细胞系中分选出的肝癌干细胞，总体约占所有肝癌细胞总数的1.94%，这一结果与相关文献报道数据是一致的[12]。

miR-200c属于miR-200家族成员，通过调控细胞的上皮-间充质转化(EMT)，以及KRAS、ZEBl等基因的功能和表达，进而调控肿瘤细胞增殖、转移和凋亡[13-14]。此外，有研究数据显示[15]，在培养的针对多柔比星耐药乳腺癌细胞株中miR-200c的表达较敏感株中明显下调，其可能的机制在于miR-200c能调控酪氨酸激酶受体B(TrkB)和Bmi-1的表达，进而影响乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。本次研究我们通过人工合成miR-200c mimics并成功转染肝癌干细胞后能导致肝癌干细胞miR-200a表达明显升高。进一步通过耐药实验发现：上调人肝癌干细胞中miR-200c的表达后，肝癌干细胞对5-Fu和ADM的IC50较干预前明显降低。以上结果表明，上调肝癌干细胞中miR-200c的表达能够提高其对化疗药物的敏感性。后续实验中，我们可通过生物学实验确定miR-200c的靶基因，进一步研究其在肿瘤耐药中的具体调控机制，为克服和逆转肿瘤细胞的多药耐药研究提供实验基础和依据。

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Influence of miR-200c up-regulation on chemotherapy resistance of liver cancer stem cells

DING Hong1, QIAN Niansong1, YANG Fan2, ZHANG Pengfei1, WANG Yanrong1, DAI Guanghai1

(1.General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; 2.Xijing Hospital of The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

Objective It is to observe the influence of miR-200c up-regulation on the characteristics of chemotherapy resistance of liver cancer stem cells.Methods Liver cancer stem cells were isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS) from MHCC97 cell line of human hepatocellular carcinoma.The miR-200c mimics were transfected into liver cancer stem cells by liposome.The expression levels of miR-200c in liver cancer stem cells were measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).MTT method was used to evaluate the chemotherapy resistance of liver cancer stem cells.Results The expression of miR-200c in liver cancer stem cells was 0.17±0.02 before transfection, and was 1.24±0.28 after transfection, there was significant difference between before and after transfection (P<0.05).The half inhibition concentration (IC50) of 5-fluorouracil (5-Fu) and adriamycin (ADM) were 22.74 mg/L and 9.56 mg/L respectively before transfection on liver cancer stem cells, and were 12.63 mg/L and 3.51 mg/L respectively after transfection, there was significant difference between before and after transfectin (all P<0.05).Conclusion Up-regulation of the miR-200c expression in liver cancer stem cells can enhance the chemotherapy sensitivity on liver cancer stem cells; it has the effect of reversing the chemotherapy resistance.

hepatocellular carcinoma; cancer stem cell; miR-200c; chemotherapy resistance

丁红，女，医师，主要从事恶性肿瘤的临床治疗与基础研究。

戴广海，E-mail:daigh60@sohu.com

北京市科技新星资助计划(xx2013107)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.24.002

R-33

A

1008-8849(2016)24-2626-03

2016-03-30