酶联免疫试剂盒检测牛血清中磺胺类药物残留

苏明明　肖姗姗　张瑜　王琦　曹际娟*

（1.辽宁出入境检验检疫局　辽宁大连　116100；2.大连出入境检验检疫局）

酶联免疫试剂盒检测牛血清中磺胺类药物残留

苏明明1肖姗姗1张瑜2王琦2曹际娟1*

（1.辽宁出入境检验检疫局辽宁大连116100；2.大连出入境检验检疫局）

利用酶联免疫试剂盒快速检测牛血清中的磺胺二甲嘧啶的残留量，方法的标准曲线为：y=-14.391x+93.317，R2=0.9996，IC50=8.3 ng/mL，线性范围为0.9-75 ng/mL，检测限为0.3 ng/mL。选择酶联免疫试剂盒中提供的MSU溶液直接提取，以2.5 ng/mL、15 ng/mL和20 ng/mL的浓度添加于空白牛血清样品，回收率为72%-96.6%，相对标准偏差为4.40%-7.41%。

磺胺二甲嘧啶；酶联免疫检测；牛血清

1　前言

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构药物的总称，是一类用以预防和治疗微生物引起疾病的化学药物［1］。SAs种类繁多，应用较广［2］，是国家允许限量使用的广谱抗菌药物，可被饲料生产者采用。磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）广泛应用于畜牧业，用以防治动物呼吸道疾病、乳房炎和球虫病等疾病，也作为饲料添加剂使用，以提高饲料效率，降低畜禽的发病率和死亡率。近几年供港澳活猪、活牛羊、活禽量连续加大，为确保供应量，防止病虫害损伤活动物，磺胺二甲嘧啶常常超量使用，导致许多细菌产生抗药性。SM2具有损害动物机体组织及致癌性，对人类的身体健康产生很大危害。国际食品法典委员会（CAC）和欧美等大多数国家规定食品和饲料中的磺胺类药物总量及磺胺二甲嘧啶等单个磺胺类药物的含量不得超过0.1 mg/kg［3-7］，日本规定食品中不得检出磺胺类药物。同时近年来国家对供港食品活动物的通关速度有更高要求，有必要建立一种方法，在快速检测活动物体内磺胺二甲嘧啶的残留量［8］同时对活动物不造成致命性损害，保证供货商的利益。

磺胺类药物检测方法有多种，目前普遍采用的是反向高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）［9-12］，但是 HPLC和HPLC-MS前处理提取方法繁琐［13-18］，操作时间长，而且要取活动物组织器官作为样品，导致动物死亡使供货商成本增加。而酶联免疫吸附测定法（ELISA）主要针对某种特定SAs及其主要代谢物，在不影响活动物生命的前提下取少量血样作为样品，前处理简单，检测方便快捷，在保证不损害活动物的同时又能快速有效检测动物体内的磺胺二甲嘧啶，加快通关速度。本项目建立了ELISA测定牛血中的磺胺二甲嘧啶。

2　材料与方法

2.1材料

2.1.1试验样品

牛血清：采自辽宁出入境检验检疫局隔离场。

2.1.2主要仪器

酶标读数仪（SUNRISE）：TECAN公司；台式高速冷冻离心机（Biofugestratos）：Heraeus公司；漩涡振荡器（MS2）：IKA公司；电子天平：Sartorious公司。

2.1.3试剂

牛血清、磺胺二甲嘧啶标准品：购自 Sigma公司；进口磺胺类药物检测试剂盒：购自德国R-biopharm 公司；磺胺类药物酶联免疫检测试剂盒、8 孔×12条酶标板（包被有偶联抗原）：美国柏尔生物技术公司；磺胺二甲嘧啶酶联免疫试剂盒（2℃-8℃）、酶标记物、磺胺二甲嘧啶抗体、底物液（A、B液）、终止液、洗涤液（浓缩液，试剂盒自带）、缓冲液（浓缩液，试剂盒自带）：购自北京博奥泰科技有限公司；乙腈、乙酸乙酯、正己烷：均为色谱纯，购自美国Merck公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：均为分析纯，购自上海国药集团。

2.2方法

2.2.1牛血清样品前处理

取0.5mL血浆加入离心管中，离心（20℃-25℃，4000 r/min）10 min；取20 μL上清液，加入80 μL 1×样品提取液F（试剂盒中自带），混匀稀释5倍后进行测定。

2.2.2吸光度值测定

将试剂盒于室温 （20℃-25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2个孔平行，并记录标准孔和样本孔所在位置。在各微孔中加入标准品或处理好的试样20 μL，然后加入酶标记物50 μL，再加入磺胺二甲嘧啶抗体80 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室温环境中反应1 h；取出酶标板，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤液工作液250 μL，洗板4-5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干；每孔加入底物液A 50μL和底物液B 50μL，轻轻振荡混匀，室温环境中避光显色30 min，加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀。设定酶标仪于450 nm处，测定每孔吸光度值。

3　结果

3.1线性范围及线性方程

用试剂盒自带标准品测定曲线，浓度分别为0.5、1.5、5、15、20、50 ng/mL，所得标准曲线及线性方程和相关系数见图1。

图1　磺胺二甲嘧啶标准曲线

根据标准曲线得到标液或样品吸光度值与其浓度的函数关系为：y=-14.391x+93.317，R2=0.9996。

布板：实验室检验时样品的分布，见表1与表2；表1中P1-P6为试剂盒中所自带的标准品，P7、P8为实验室人为配制的标准品。

表1　标准品布板图

表2　表1对应的标准品的浓度（单位：ng/mL）

3.2回收率验证

在牛血清的空白样品中分别添加 2.5、15、20 ng/mL 3个水平的磺胺二甲嘧啶，按照上述处理方法进行分析，每个浓度水平做6个平行试验，结果见表3。

表3　牛血清样本间精密度及回收率的检验结果

表3显示，加标回收率为72%-96.6%，符合60%-110%的规定；相对标准偏差为4.40%-7.41%，即方法的准确率也在规定的范围之内。由此可见，该检测方法能充分满足要求。

3.3检出限

12个自配0.5 ng/mL磺胺标准品测定浓度均值为0.5056 ng/mL，结果显示检出数据与标准品浓度非常接近，说明用此试剂盒检测结果制成的标准曲线及检出限均符合卫生部规定。因此，依据此试剂盒提供血清样品的检出限为2.5 ng/mL。

3.4不同磺胺类药物的交叉反应率

交叉反应率是反映抗原抗体特异性好坏的指标，交叉反应率越高，说明特异性越差；反之，则表明特异性越好。一般交叉反应率的测试操作和计算如下：

按一定浓度配制待测物标准品和相似药物标准品，用待测物抗原或者抗体包被酶标板，配制一定浓度抗体或者酶标记抗原，进行ELISA间接竞争结合反应，最后对比两组曲线，分别计算B/B0百分比（即每个标准品的OD值与0标OD值的百分比），找出IC50点 （即抑制率B/B0在50%时对应的标准品浓度），用待测药物的IC50浓度除上相似物的IC50浓度，得到的百分比就是待测药物与其相似药物的交叉反应率。

计算公式：S=Y/Z×100%

式中：S-交叉反应率；Y-待测物IC50浓度；Z-相似物IC50浓度。

以磺胺喹噁啉93%的交叉反应率为例：用磺胺类试剂盒标准品和磺胺喹噁啉药物分别配制6个点标准曲线，在磺胺类试剂盒的酶标板和抗体上进行反应，测试出两组曲线的IC50点，然后计算出交叉反应率。

表4　磺胺类物质交叉反应率

4　结论

相比于其他基于抗原抗体反应免疫分析法，ELISA检测灵敏度高、方法简单、配套技术成熟，可以满足现有痕量检测技术的要求。此方法能实际结合供港澳活动物检验检疫特点，既能保证动物不受损害，又能减少供货商损失。与液质联用方法相比，该检测方法制备较为简单、快速，分析技术利用抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，具有耗时少、灵敏度高。此方法是快速筛选方法，一旦出现阳性结果，可采用LC-MS-MS或者GCMS-MS进行进一步定性分析。

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The Detection of Sulfa Drug Residues Using ELISA for Bovine Serum

SU Mingming1，XIAO Shanshan1，ZHANG Yu2，WANG Qi2，CAO Jijuan1*
（1.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian，Liaoning，116001；2.Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Based on anti-sulfamethazine monoclonal antibody，an ELISA method to detect sulfamethazine in cow serum is established.The formula was y=-14.391x+93.317，R2=0.9996，and the 50%in hibition concentration（IC50）was 8.3 ng/mL with the limit of detection of 0.3 ng/mL.The linear detecting range of calibrationcurve was from 0.9 ng/mL to 75 ng/mL.When the spiked concentrations of sulfamethazine were 2.5 μg/kg，15 μg/kg，and 20 μg/kg in blank feed，there covery was 72%-96.6%with coefficients of variation of 4.40%-7.41%.

Sulfamethazine；ELISA；Serum

S859.84

E-mail：meng8135@163.com；*通讯作者E-mail：caojijuanlnciq@163.com

国家质检总局出入境检验检疫行业标准制修订项目（2013B312）

2015-09-17