乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32表达情况的研究

张晶晶，谢永富，胡建峰，刘会晶，孙宏勋（河北医科大学第三医院 检验科，河北 石家庄 050051）



乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32表达情况的研究

张晶晶，谢永富，胡建峰，刘会晶，孙宏勋
（河北医科大学第三医院 检验科，河北 石家庄 050051）

目的探讨乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32（IL-32）的表达以及临床意义。方法用Lipofectamine 2000TM介导转染HepG2细胞。转染48 h后，采用聚合酶链反应（RT-PCR），蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测HepG2细胞中IL-32的mRNA及蛋白的表达量。结果RT-PCR结果显示转染HBV的HepG2细胞中IL-32 mRNA的表达量比转染空载体（未转染）的细胞中IL-32 mRNA高2.3倍；Western blot结果显示与空载体转染的HepG2细胞比较，转染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2细胞中IL-32蛋白质表达增高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结论HBV促进IL-32蛋白的表达，从而证实乙型肝炎的严重程度与IL-32的表达有关。

乙型肝炎病毒蛋白；IL-32；表达；研究

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是目前严重威胁人类健康的病毒之一。HBV感染肝细胞后不仅极易引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等疾病，而且还会提高肝癌的发生率［1］。HBV感染宿主后，正常的免疫应答可以清除乙肝病毒，表现为急性一过性的感染。若是细胞免疫功能低下或紊乱者，则无法清除乙肝病毒，最终将成为慢性感染者［2］。白细胞介素32（Interleukin，IL-32）是一种重要的炎症因子，主要经免疫细胞表达，IL-32为促炎因子。IL-32在丙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒引起的炎症性疾病中发挥重要作用［3-4］。IL-32是否参与乙型病毒性肝炎的发病，国内外研究甚少，本研究在分子生化水平对HBV是否诱导IL-32的表达进行初步探索。

1　材料与方法

1.1实验材料

细胞株：人肝癌细胞株HepG2细胞（购自北京协和技术所细胞库），主要试剂：主要试剂及来源见表1。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养HepG2细胞培养在含10%胎牛血清、10%青链双抗的DMEM培养基中，于37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养，待贴壁细胞处于生长期时进行传代。

1.2.2质粒转染细胞用脂质体 Lipofectamine 2000TM介导转染，在转染前1 d换用不含双抗的培养液，调整HepG2细胞浓度为1×105个/rat，将其接种于24孔板中，每孔1 ml。用OPTI-MEM稀释质粒和脂质体，当细胞贴壁密度达到90%融合时，把质粒、脂质体混合物加至细胞中。转染6 h后更换培养液为含双抗的培养液，第2天荧光下观察转染率达50%。

1.2.3RT-PCR检测HBV转染IL-32 mRNA的表达量将上述细胞培养48 h后，除去培养液，用PBS（phosphate-buffered saline，PBS）洗2次，然后加入Trizol。按试剂盒说明提取总RNA。采用分光光度法（A260/280 nm值）检测每一个RNA样本的质量。利用反转录试剂盒对总RNA进行逆转录。采用SYBR GreenⅠ染料法对IL-32基因的表达量进行检测，反应体系为25μl：2×Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Bio-system）10μl，10μmol/L的正反向引物各加1μl，模板为总RNA逆转录所得的cDNA，用灭菌双蒸水补足至25μl。各处理组分别做3～4个平行样品，每个样品再分别平行做3个重复。各个样品的反应条件为：95℃、3 min，40个循环：95℃、15 s，60℃、45 s；60℃延伸步骤进行荧光信号的采集。反应结束后，收集本反应体系的融解曲线，以此分析PCR产物的特异性。目的基因相对表达量分析方法采用 2-△△CT法计算。IL-32引物参照KOBAYASHI等［5］：正向引物5'-CGACTTCAAAGAGG GCTACC-3'，反向引物5'-GAGTGAGCTCTGGGTGC TG-3'；β-actin引物：正向引物5'-TCGTCCACCGCA AATGCTTCTAG-3'，反向引物5'-ACTGCTGTCACCT FCACCGTTCC-3'，采用双△t法计算结果。

1.2.4蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HBV转染IL-32蛋白的表达量影响收集未转染以及转染48 h的细胞，冲洗2次，置放射免疫沉淀分析缓冲液中萃取蛋白，置冰上30 min。采用超声匀浆器处理标本，用未转染细胞做对照，采用Lowry法测定蛋白浓度。采用10%SDS-PAGE（150 V，2 h）分离蛋白，并转到硝酸纤维膜上，用5%的牛血清白蛋白封闭1 h，加1∶2 000的Mouse anti-IL-32单抗孵育过夜，第2天，冲洗掉一抗，在用1∶5 000的辣根过氧化酶结合的Goat anti-mouse IgG孵育1 h。采用增强化学发光法检测蛋白质。Mouse-anti-β-actin单克隆抗体作为内对照。

表1　试剂列表

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HBV对IL-32 mRNA的表达量的影响

实时荧光定量PCR结果显示，转染HBV 48 h后的HepG2细胞，比转染空载体（未转染）的细胞中的IL-32 mRNA表达量高2.3倍（见图1，2和表2），并且溶解曲线显示IL-32，以及β-actin的引物特异性良好，进一步显示数据具有可靠性。

结果可见，通过对未转染细胞和转染细胞中βactin统计分析可以看出，β-actin表达在两组比较差异无统计学意义，而对未转染细胞和转染细胞中RNA IL-32 mRNA的含量可以看出未转染细胞RNA IL-32 mRNA表达明显高于转染细胞，差异有统计学意义，见表2。

2.2HBV对IL-32蛋白的表达量的影响

图1　未转染细胞中IL-32及β-actin的扩增曲线

图2　转染细胞中IL-32及β-actin的扩增曲线

Western blot结果显示，转染48h的HepG2细胞，与空载体转染的HepG2细胞比较，转染HBV的HepG2细胞中IL-32蛋白质表达显著增高（P＜0.05）。见表3和图3。

表2　HBV对IL-32 mRNA的表达量影响 （dRn±s）

表2　HBV对IL-32 mRNA的表达量影响 （dRn±s）

表3　HBV对IL-32蛋白的表达量的影响

图3　Western blot结果图

3　讨论

近年的研究［6-7］证实，细胞因子在HBV感染所引起的肝损伤中发挥重要作用。许春梅等［8］检测HBV患者血清中IL-32水平，发现IL-32水平与HBV感染者的炎症严重程度相关，并且随炎症程度的加重IL-32呈上升趋势。PAN等［9］证明HBV的X蛋白（HBx）通过IL-32的启动子（从-746到+25）以剂量依赖的方式增强IL-32的表达。IL-32是2005年KIMETAL［10］在用基因芯片方法研究IL-18可诱导基因时发现的一种新型白细胞介素。越来越多的研究表明，IL-32在机体的免疫调节方面发挥着重要作用，它与慢性炎症性疾病、细菌感染性疾病、肿瘤和病毒感染性疾病等密切相关［11］。疾病中所起的作用不同，IL-32可以诱导IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα及MIP-2等细胞因子的表达，与HCV［3］、HPV等［12］多种病毒感染引起的疾病的发病密切相关。IL-32基因位于人染色体16p13.3上，有8个外显子，有6种以上剪接变异体，目前比较明确的是 IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ6种［13］。

IL-32可由多种细胞刺激产生，如T淋巴细胞可在丝裂原等的刺激下、在IL-12和IL-18的共同作用下或在TNF-α的作用下产生，NK细胞可在IL-12和IL-18的共同作用下产生，单核细胞和B细胞均可在活化T细胞的辅助下产生，上皮细胞在IFN-γ的作用下亦可产生等［14］。本研究中显示转染HBV的HepG2细胞比未转染的HepG2细胞中的 IL-32 mRNA的表达量高2.3倍，说明HBV促使IL-32 mRNA的表达，是由于HBV感染引起肝损伤与增加炎症因子的表达有关。同时，本研究结果显示，转染HBV的HepG2细胞中IL-32蛋白比未转染HBV的细胞中IL-32蛋白表达量高，说明HBV促进HepG2细胞中的IL-32蛋白的表达。本研究发现，转染HBV表达载体的HepG2细胞内及培养上清液中均表达IL-32，分泌表达的IL-32可通过诱导其他炎症细胞因子的表达而引起炎症疾病的发生，进一步从蛋白水平说明HBV感染引起肝损伤与增加炎症因子的表达有关。

综上所述，本文通过检测转染及未转染HBV的HepG2细胞中的IL-32 mRNA及蛋白的表达量，探究HBV对IL-32的表达，研究结果证明HBV对IL-32的mRNA及蛋白的表达均有促进作用。

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［3］MOSCHEN A R，FRITZ T，CLOUSTON A D，et al.Interleukin-32:anewproinflammatorycytokineinvolvedinhepatitisC virus-related liver inflammation and fibrosis［J］.Hepatology，2011，53（6）:1819-1829.

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［12］LEE S，KIM J H，KIM H，et al.Activation of the interleukin-32 proinflammatory pathway in response to human papilloma virus infection and over-expression of interleukin-32 controls the expression of the human papilloma virus oncogene［J］.Immunology，2011，132:410-420.

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［14］NETEA M G，AZAM T，FERWERDA G，et al.IL-32 synergizeswithnucleotideoligomerizationdomain（NOD）1and NOD2 ligands for IL-1 beta and IL-6 production through a caspase 1-dependent mechanism［J］.USA Proc Natl Acad Sci，2010，102（45）:16309-16314.

（张蕾编辑）

Expression of IL-32 induced by hepatitis B virus protein

Jing-jing Zhang，Yong-fu Xie，Jian-feng Hu，Hui-jing Liu，Hong-xun Sun
（Department of clinical laboratory，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050051，China）

Objective To investigate whether protein of hepatitis B virus induced the expression ofIL-32. Methods HepG2 was mediated transfected by Lipofectamine 2000 TM.After 48 hours，the expressions of IL-32 mRNA and protein in HepG2 cells were detected by RT-PCR and western blot respectively.Results RT-PCR result showed expressions of IL-32 mRNA in HepG2 cells transfected with HBV were 2.3 times higher than the cells transfected with empty vector（non-transfected）.Western blot result showed that，compared with the IL-32 protein in untransfected HepG2 cells，expression ofIL-32protein in transfected pIRES2-HBV-EGFP HepG2 cells was increased，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The expression ofIL-32mRNA，IL-32protein in HepG2 cells is promoted by HBV.

hepatitis B virus protein；IL-32；expression；study

R575.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.007

1005-8982（2016）16-0035-04

2016-04-08

谢永富，E-mail：xieteng811@sohu.com；Tel：13503339862