坏死性凋亡和p38 MAPK通路的相互作用介导高糖引起的H9c2 心肌细胞损伤

梁伟杰，何洁仪，陈君，余盛龙，张稳柱，宋明才，陈景福，冯鉴强，廖新学

(1. 广州市番禺区中心医院心血管内科，2. 广州市番禺区心血管疾病研究所，广东 广州　511400； 3. 中山大学附属第一医院黄埔院区心血管内科CCU，广东 广州　510700；4. 中山大学附属第一医院心血管内科，广东 广州　510080)



坏死性凋亡和p38 MAPK通路的相互作用介导高糖引起的H9c2 心肌细胞损伤

梁伟杰1,2，何洁仪1,2，陈君1,2，余盛龙1,2，张稳柱1,2，宋明才1,2，陈景福3，冯鉴强4，廖新学4

(1. 广州市番禺区中心医院心血管内科，2. 广州市番禺区心血管疾病研究所，广东 广州511400； 3. 中山大学附属第一医院黄埔院区心血管内科CCU，广东 广州510700；4. 中山大学附属第一医院心血管内科，广东 广州510080)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.021

目的研究坏死性凋亡(necroptosis，Nec)和p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的相互作用在高糖引起H9c2 心肌细胞损伤中的作用。方法应用细胞计数盒检测心肌细胞存活率；双氯荧光素染色荧光显微镜照相法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平；罗丹明 123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)；蛋白质免疫印迹法测定RIP3蛋白(反映Nec的指标)和p38MAPK蛋白的表达水平。结果高糖(35 mmol·L-1葡萄糖，HG)作用H9c2心肌细胞24 h可引起明显的细胞损伤，表现为细胞存活率降低，ROS生成及MMP丢失增多；应用100 μmol·L-1necrostatin-1(Nec-1，Nec特异性抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h或3 μmol·L-1SB203580(p38MAPK抑制剂)预处理心肌细胞60 min，再予HG作用24 h可减轻高糖引起的上述损伤。此外，HG作用心肌细胞1、3、6、9、12、24、36和48 h均能明显增加RIP3蛋白的表达水平，其中24 h时表达水平增加最明显。应用100 μmol·L-1Nec-1共处理或3 μmol·L-1SB203580预处理心肌细胞均能明显地抑制HG对RIP3蛋白表达的上调作用。另一方面，应用100 μmol·L-1Nec-1共处理心肌细胞能阻断HG对磷酸化(p)-p38MAPK表达的上调作用。结论Nec和p38 MAPK通路的相互作用介导高糖引起H9c2 心肌细胞损伤。

坏死性凋亡；p38丝裂原激活蛋白激酶；相互作用；高糖；心肌细胞；损伤

细胞死亡是生命的基本过程，不仅参与生物的发育和自稳平衡，在多种疾病的发生、发展过程中也发挥重要的作用。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病的重要并发症之一，严重地危害着人类的健康与生命。在DCM发生过程中，心肌细胞死亡起关键性的启动作用。Cai等[1]报道：在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡。细胞死亡可分为凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)、自噬(autophagy)和坏死性凋亡(necroptosis，Nec)[1-5]。Nec是Degterev等于2005年首次报道的一种细胞死亡方式，广泛参与缺血性心脑血管疾病、肝肾脏器损害、肿瘤及炎症反应等病理生理过程[3,6-8]。在启动Nec过程中，受体相互作用蛋白(receptor interaction protein，RIP)发挥重要的作用。目前，RIP蛋白家族由RIP1～RIP7共7个成员组成，其中RIP1 和RIP3 是参与Nec的重要分子蛋白，两者的活化并形成复合物是启动Nec的关键。多项实验证实，RIP3是调控Nec的特异性蛋白因子，过量表达的RIP3可导致Nec发生，沉默或下调RIP3的表达可不同程度地阻止细胞发生Nec[7,9-10]。有研究报道，在链脲霉素(streptozotocin)诱导的糖尿病大鼠，心肌纤维化、肥厚、炎症的发生伴随着RIP3的大量表达[11]，提示Nec可能参与高血糖引起的心肌损伤。另有报道指出：Nec与p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的关系非常密切，p38MAPK通路可介导Nec的发生[12-13]。但是，在DCM细胞模型中，Nec能否介导高糖(high glucose, HG)引起的心肌细胞损伤，Nec与p38MAPK之间的关系如何，目前尚未见报道。

为此，本研究通过HG损伤H9c2心肌细胞建立DCM细胞模型[14]，旨在探讨：① Nec能否介导HG引起的心肌细胞损伤；② 在HG损伤心肌细胞过程中，Nec和p38MAPK通路之间是否存在相互作用关系。

1　材料与方法

1.1材料抗RIP3抗体、抗p-p38MAPK抗体和抗t-p38MAPK抗体购自Cell Signaling(USA)；特级胎牛血清购自Gibco BRL(USA)；DMEM培养基由Hyclone公司(USA)供应；罗丹明123(rhodamine 123, Rh 123)和双氯荧光素( 2’，7’-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)、SB203580(p38MAPK通路抑制剂)、necrostatin-1(Nec-1，Nec特异性抑制剂)购自Sigma-Aldrich(USA)；SB203580和Nec-1按照产品说明采用二甲基亚砜(DMSO)溶解后、DMEM培养基稀释至目标浓度使用；细胞计数试剂盒8(cell counter kit-8, CCK-8)由Dojindo Lab(Japan)提供；H9c2 心肌细胞取自中山大学实验动物中心。

1.2细胞培养及实验分组H9c2 心肌细胞来源于大鼠胚胎期的心脏组织，置于含5% CO2的37 ℃温箱中，于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。实验分为6组：(A)对照(control)组：DMEM培养基(5.5 mmol·L-1葡萄糖)处理心肌细胞24 h；(B)高糖(high glucose, HG)组：35 mmol·L-1葡萄糖作用心肌细胞24 h；(C)Nec-1+HG组：100 μmol·L-1Nec-1和35 mmol·L-1葡萄糖共处理心肌细胞24 h；(D)SB203580+HG组：3 μmol·L-1SB203580作用心肌细胞60 min，撤去，PBS洗2次，然后35 mmol·L-1葡萄糖处理心肌细胞24 h；(E)Nec-1组：100 μmol·L-1Nec-1和DMEM培养基共处理心肌细胞24 h；(F) SB203580组：3 μmol·L-1SB203580作用心肌细胞60 min，撤去，PBS洗2次，然后DMEM处理心肌细胞24 h。

1.3CCK-8 测定心肌细胞存活率将H9c2 心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长至约80%培养孔面积时，按照分组采取不同的处理后，弃上清， PBS液洗3次，于每孔加入90 μL DMEM和10 μL CCK-8溶液，37 ℃温箱中孵育2.5 h，酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(A)。取5孔A值的平均数，按以下的公式计算细胞存活率：细胞存活率/%=处理组A /对照组A×100%。实验重复5次。

1.4DCFH-DA染色测定细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平将H9c2 心肌细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长至约80%培养孔面积时，按照分组采取不同处理后，PBS液洗3次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA染液，37℃温箱中孵育30 min，然后用PBS液洗3次。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，用ImageJ 1.47i软件分析5个视野绿色荧光强度的平均值[平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)，能间接反映ROS水平，数值越大，表示ROS水平越高]，并进行数据统计分析。实验重复5次。

1.5Rh 123染色测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)将H9c2 心肌细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长至约80%培养孔面积时，按照分组采取不同处理后，PBS液洗3次，加入10 μg·L-1Rh 123染液，37 ℃温箱中孵育45 min，然后PBS液洗3次。在荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，细胞核周围绿色的亮点即为摄取了Rh 123的线粒体。Image J 1.47i软件分析5个视野绿色荧光的MFI(其数值大小可反映MMP水平高低)，并进行数据统计分析。实验重复5次。

1.6蛋白质免疫印迹法检测RIP3和p38MAPK蛋白的表达水平将H9c2 心肌细胞接种于60 mm培养皿中，培养至约80%满时，按照实验分组采取不同的处理后，去上清液，PBS液洗涤后加入细胞裂解液，4 ℃摇床中作用30 min，14 000×g高速离心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸法进行蛋白定量。总蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到二氟化树脂膜上。5%脱脂奶粉常温下封闭60 min，随后分别加入抗RIP3、抗t-p38或抗p-p38 抗体(浓度为1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，用预冷的TBST洗3 次，每次5 min，然后与相应的二抗(浓度为1 ∶2 500)室温下孵育1.5 h，再予TBST洗3次，每次5 min。用增强化学发光法使二氟化树脂膜显色，暗室中将显色条带曝光到医用X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。实验重复5次。

2　结果

2.1Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌细胞毒性Fig 1A显示，35 mmol·L-1葡萄糖(高糖，HG)作用心肌细胞24 h可引起明显的心肌细胞毒性，降低细胞存活率，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。分别应用75、100、200、400、600、800 μmol·L-1Nec-1与HG共处理心肌细胞24 h，均能使细胞存活率升高，与HG组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中100 μmol·L-1Nec-1对细胞毒性的抑制作用最为明显。单纯采用75、100、200、400、600、800 μmol·L-1Nec-1和DMEM分别共处理心肌细胞24 h均不影响细胞存活率(Fig 1B)。根据上述结果，本研究采用Nec-1的作用浓度为100 μmol·L-1。

与Nec-1的作用相类似，在HG作用前，应用3 μmol·L-1SB203580预处理心肌细胞60 min，也可提高细胞存活率，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。3 μmol·L-1SB203580本身对心肌细胞存活率无明显的影响(Fig 1C)。

Fig 1　Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced cytotoxicity in H9c2 cardiac cells (n=5)

1: Control; 2: Glucose 35 mmol·L-1; 3: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; 4: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; 5: Nec-1 100 μmol·L-1. 6: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.2Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌细胞ROS堆积Fig 2B显示，采用HG作用H9c2 心肌细胞24 h可使胞内DCFH-DA的MFI升高至(31.4±1.37)%，与正常对照组[MFI值为(11.1±0.81)%，Fig 2A]相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。然而，100 μmol·L-1Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h，可使MFI降低至(15.7±1.07)%，与HG组比较，两者差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 2C)。单纯100 μmol·L-1Nec-1和DMEM共处理心肌细胞24 h对心肌细胞ROS的生成无明显的影响(P>0.05，Fig 2E)。

与Nec-1的作用相类似，在HG作用前，应用3 μmol·L-1SB203580预处理心肌细胞60 min，可使MFI降低至(14.2±0.78)%，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 2D)。3 μmol·L-1SB203580对心肌细胞ROS的生成无明显的影响(P>0.05，Fig 2F)。

Fig 2　Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.3Nec-1和SB203580抑制高糖引起的心肌细胞MMP丢失Fig 3显示，采用HG作用H9c2 心肌细胞24 h可使胞内Rh 123的MFI从(31.5±1.20)%(正常对照组，Fig 3A)降低至(10.6±0.90)%(Fig 3B)，两组差异具有统计学意义(P<0.01)。采用100 μmol·L-1Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h，可使MFI升高至(21.8±1.14)%(Fig 3C)，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。单纯Nec-1本身对心肌细胞MMP无明显的影响(P>0.05，Fig 3E)。

与Nec-1的作用相类似，在HG作用前，应用3 μmol·L-1SB203580预处理心肌细胞60 min，可使心肌细胞内Rh 123的MFI升高至(20.5±1.20)%，与HG组比较，两者差异具有统计学意义(P<0.01，Fig 3D)。SB203580本身对心肌细胞MMP无明显的影响(P>0.05，Fig 3F)。

Fig 3　Nec-1 and SB203580 inhibit HG-induced mitochondrial membrane potential (MMP) loss in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.4HG促进心肌细胞RIP3蛋白的表达Fig 4显示，HG分别作用H9c2心肌细胞1、3、6、9、12、24、36和48 h均能增加RIP3蛋白的表达，与正常对照组比较，差异均具有统计学意义(P均<0.01)，其中HG作用心肌24 h时，RIP3表达增加最明显。

2.5Nec-1和SB203580减弱HG对心肌细胞RIP3蛋白表达的上调作用如前所述，HG可上调心肌细胞RIP3蛋白的表达；在HG作用前，应用100 μmol·L-1Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h或应用3 μmol·L-1SB203580预处理60 min后，再予HG作用心肌细胞24 h，RIP3的表达水平明显减少，与HG组对比，差异均具有统计学意义(P均<0.01)。100 μmol·L-1Nec-1或3 μmol·L-1SB203580本身对心肌细胞RIP3蛋白的基础表达无明显的影响(Fig 5)。

Fig 4　HG promotes expression of RIP3 protein in H9c2 cardiac cells (n=5)

H9c2 cardiac cells were exposed to HG for a 48 h period.**P<0.01vscontrol group.

Fig 5　Nec-1 and SB203580 attenuate HG-induced up-regulation of RIP3 expression in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; D: SB203580 3 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1. F: SB203580 3 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

2.6Nec-1减轻HG对心肌细胞磷酸化p38MAPK表达的上调作用Fig 6显示，应用HG处理心肌细胞24 h可使p-p38MAPK表达水平明显增加，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。应用100 μmol·L-1Nec-1和HG共处理心肌细胞24 h，p-p38MAPK的表达水平明显降低，与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。100 μmol·L-1Nec-1本身对心肌细胞p-p38MAPK的基础表达无明显的影响。

Fig 6　Nec-1 attenuates HG-induced up-regulation of p-p38MAPK expression in H9c2 cardiac cells (n=5)

A: Control; B: Glucose 35 mmol·L-1; C: Nec-1 100 μmol·L-1+ Glucose 35mmol·L-1; E: Nec-1 100 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsthe HG-treated group.

3　讨论

心肌细胞死亡在DCM的发生过程中发挥重要作用[1]。细胞的死亡方式包括apoptosis、necrosis、autophagy和Nec[1-5]。已有实验证实：apoptosis、necrosis和autophagy参与DCM的发生和发展[2,3,15]。然而，Nec是否参与高血糖引起的心肌细胞损伤，目前尚未完全明了。最近，Liu等[11]观察到，糖尿病大鼠在出现左心室重构及舒张功能障碍的同时，伴随有RIP3表达明显增加，提示Nec与糖尿病大鼠心肌损伤有关。但是，他们没有应用抑制Nec的技术与方法进一步探讨Nec在糖尿病心肌损伤中的作用。本实验在观察到HG引起心肌细胞损伤(包括细胞毒性、氧化应激和线粒体损伤)的同时，能明显地上调心肌细胞RIP3蛋白的表达，采用Nec的特异性抑制剂Nec-1共处理心肌细胞不仅能减轻HG引起的心肌细胞损伤，使细胞存活率升高，ROS生成及MMP丢失减少，而且能明显地抑制RIP3表达的上调。上述结果清晰地提示：Nec介导HG引起的心肌细胞毒性、氧化应激和线粒体受损等损伤，这从细胞学水平进一步深化了Liu等[11]的研究结果，为阐明Nec在糖尿病心肌损伤中的作用提供了新颖的实验依据。

重要的是，我们进一步探讨了Nec与p38MAPK通路的关系。p38MAPK通路是MAPK家族的重要成员之一，可被各种刺激(如炎症、缺血缺氧、化学损伤等)激活，参与调控细胞生长、分化、凋亡等病理生理过程[16-17]。本研究和我们之前的研究[14，18]表明，Nec和p38MAPK通路可介导HG引起的H9c2 心肌细胞损伤，然而它们两者之间的关系尚不清楚。在本实验中，Nec的抑制剂Nec-1能明显地抑制HG对p-p38MAPK表达的上调，提示Nec可通过激活p38MAPK通路引起心肌细胞损伤，这与之前其他细胞模型的研究结论相似[12-13]；另一方面，p38MAPK通路的抑制剂SB203580能对抗HG引起RIP3表达的上调，提示HG激活的p38MAPK通路可促进Nec的发生。因此，我们的研究证实：在HG损伤心肌细胞模型中，HG可激活p38 MAPK通路和诱导Nec发生，两者之间存在正相互作用，Nec可激活p38MAPK通路，而激活的p38MAPK通路也可促进Nec的发生，两者之间形成一个正反馈回路，在HG引起的心肌细胞毒性、氧化应激和线粒体损伤过程中发挥重要作用。

综上所述，本实验证实，Nec可介导HG诱导的H9c2 心肌细胞损伤，Nec与p38MAPK通路之间的正相互作用可能是HG引起心肌细胞损伤的重要机制之一。

(致谢：本实验在中山大学中山医学院科技楼开展，感谢冯鉴强教授和廖新学教授对本实验设计、文稿书写提出了很多宝贵的意见和建议。)

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Interaction between necroptosis and p38MAPK pathway mediates high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells

LIANG Wei-jie1,2, HE Jie-yi1,2, CHEN Jun1,2, YU Sheng-long1,2,ZHANG Wen-zhu1,2, SONG Ming-cai1,2,CHEN Jing-fu3, FENG Jian-qiang4, LIAO Xin-xue4

(1.DeptofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict，Guangzhou511400,China; 2.CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China; 3.CardiacCareUnitofDeptofCardiology,HuangpuDivisionoftheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China; 4.DeptofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

AimTo investigate the role of the interaction between necroptosis (Nec) and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway in the high glucose (HG)-induced H9c2 cardiac cells injury. MethodsThe cell viability was measured by cell counter kit-8 assay. The intracellular level of reactive oxygen species (ROS) was tested by DCFH-DA stating followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was detected by Rhodamine 123 staining followed by photofluorography. The expression levels of receptor interaction protein 3 (RIP3, an indicator of Nec) and p38MAPK protein were tested by Western blot assay. ResultsThe treatment of H9c2 cardiac cells with 35 mmol·L-1glucose (high glucose, HG) for 24 h induced considerable injuries, including a decrease in cell viability, increases in ROS generation as well as MMP loss. The co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1necrostatin-1(Nec-1，a specific inhibitor of Nec)and HG for 24 h or the pre-treatment of the cells with 3 μmol·L-1SB203580 (an inhibitor of p38MAPK) for 60 min before HG exposure attenuated the above injuries induced by HG. Moreover, the treatment of the cells with HG for 1,3,6,9,12,24,36 and 48 h significantly increased the expression levels of RIP3, peaking at 24 h. The co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1Nec-1 or the pre-treatment of the cells with 3 μmol·L-1SB203580 considerably blocked the up-regulation of RIP3 expression induced by HG. On the other hand, the co-treatment of the cells with 100 μmol·L-1Nec-1 alleviated the HG-induced up-regulation of the expression of p-p38MAPK. ConclusionThe interaction between Nec and p38MAPK pathway mediates the HG-induced injury in H9c2 cardiac cells.

necroptosis; p38 mitogen-activated protein kinase; interaction; high glucose; cardiomyocyte; injury

2016-03-15，

2016-04-15

国家自然科学基金资助项目(No 81270296)；广东省财政科技项目(No 2014SC107)

梁伟杰(1981-)，男，硕士，主治医师，研究方向：心血管介入和心血管疾病的保护机制，Tel: 020-34859342，E-mail：279096515@qq.com；

廖新学(1965-)，男，博士，主任医师，博士生导师，研究方向：心血管疾病的损伤与保护机制，通讯作者，Tel: 020-87332628，E-mail：liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

A

1001-1978(2016)08-1138-07

R322.11；R329.25；R341；R345.57；R587.1

网络出版时间：2016-7-19 10:43网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.042.html