药学本科中药化学自主设计性实验实践探索*

王　政，李春艳，刘　伟，董中云，沈颂章，苏　娟

(1 第二军医大学药学，上海　200433；2 第二军医大学药学院实验教学中心，上海　200433)



药学本科中药化学自主设计性实验实践探索*

王政1，李春艳1，刘伟1，董中云1，沈颂章2，苏娟2

(1 第二军医大学药学，上海200433；2 第二军医大学药学院实验教学中心，上海200433)

为了让学生更好的掌握中药有效部位的制备和含量测定的方法和操作，开展山楂叶总黄酮制备及含量测定的自主设计性实验。实验教学以小组为单位进行，学生查阅相关文献，自主设计实验方案，并在老师指导下完善方案。小组合作完成山楂叶总黄酮的制备及含量测定后，对实验结果进行合理分析得出结论，提出进一步的改进方案，并对整个设计性实验教学过程进行总结和讨论。

中药化学；自主设计性实验；山楂叶总黄酮；制备；含量测定

中药化学是药学本科教育中一门必不可少的专业课，是药学学科的重要组成部分。近年来，随着中药现代化、国际化发展趋势，中药化学课程愈加重要。为了让药学学生在能够综合运用所学理论知识的同时，熟练掌握中药化学实验技能并应用到实践中，《中药化学》授课期间开展了自主设计性实验教学，以山楂叶总黄酮的制备和含量测定为实验任务，培养学生对实际问题的探究能力和批判性思维，增强学生文献查阅、实验设计以及团队合作等方面的能力，在教学实践中提高学生的实践能力和专业素养[1-2]。

1　实验准备

实验开始前两周，我们接到实验任务，通过查阅药典和相关文献，制定了设计实验方案，在老师的指导下完善方案后开展实验；最后结合实验中的相关问题分析实验结果，以科研论文的形式递交实验论文。

1.1文献查阅及方案确定

本组成员共有4人，两人查阅药典及相关文献资料。目前山楂叶的研究较为完善，文献量较多，我们以山楂叶、总黄酮、制备和含量测定为关键词检索中文文献，搜索范围包括万方数据、重庆维普等，精选文献作为参考[3-12]；交流讨论后，初步拟定实验方案，与老师讨论相关细节，对实验具体的操作步骤、所用溶剂等问题进行细化，使实验方案成为可操作的流程指导。

实验选择渗漉法、超声法为提取方法，选择萃取法、大孔吸附树脂法为分离方法，利用两种提取方法和两种分离方法，得到四组产品(甲组：渗漉法-萃取法；乙组：渗漉法-大孔吸附树脂法；丙组：超声法-萃取法；丁组：超声法-大孔吸附树脂法)。最后以药典规定检测山楂叶总黄酮含量的紫外-可见分光光度法对四组产品进行含量测定。

1.2流程安排

整个实验分为四组、三个部分，共分三次完成，实验流程如图1。

图1　山楂叶总黄酮制备流程

2　实验内容

2.1材料与仪器

材料：山楂叶；芦丁对照品；石油醚；乙酸乙酯；蒸馏水；型大孔吸附树脂(HP-20)；工业乙醇；5%亚硝酸钠溶液；10%硝酸铝溶液；氢氧化钠试液。

仪器：电子天平(JY220)；万分之一天平(AL104)；超声仪(HK6200)；渗漉筒；烧杯；锥形瓶(1000 mL)；圆底烧瓶(500 mL，1000 mL)；烧杯(500 mL)；玻璃棒；分液漏斗(250 mL)；旋蒸仪(NE6000-2)；载玻片；紫外分光光度计(Spectrumlab752Pro)；50 mL容量瓶；100 mL容量瓶。

2.2实验操作

2.2.1提取

渗漉法：取山楂叶适量，粉碎成粗粉，称取山楂叶粗粉40 g，加入少量乙醇浸润，装入渗漉筒，加入工业乙醇400 mL，浸泡3 h后，开始渗漉，渗漉速度为5 mL/min，收集全部渗漉液，浓缩至约40 mL，分为甲、乙两组，各约20 mL。

超声法：取山楂叶适量，粉碎成粗粉，称取山楂叶粗粉40 g，放入具塞的1000 mL锥形瓶中，加入工业乙醇400 mL，60 ℃超声提取50 min，过滤后，减压回收乙醇，浓缩至约40 mL，分为丙、丁两组，各约20 mL。

2.2.2精制

萃取法：甲、丙两组浓缩液中分别加入蒸馏水50 mL稀释，加入石油醚40 mL，萃取，静置分层后，分液，弃去石油醚层。水层中加入乙酸乙酯100 mL，共分三次加入，萃取，静置分层后，分液，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到黄褐色粉末，甲组得0.64 g，丙组得0.84 g。

树脂法：取大孔吸附树脂200 mL，平均分为两份，分别装柱。乙、丁两组浓缩液分别上样后，先用700 mL蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；然后用500 mL 30%乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用500 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到黄褐色粉末，乙组得0.27 g，丁组得0.42 g。

2.2.3含量测定

2.2.3.1对照品溶液的配制

精密称取芦丁对照品20.1 mg，置100 mL量瓶中，加乙醇适量，超声处理溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。

2.2.3.2标准曲线的制备

精密量取对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，在加水至刻度，摇匀，静置15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标(Y)，浓度(C)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=10.32X-0.018，r2=0.999

2.2.3.3提取物的含量测定

精密称取山楂叶提取物约0.05 g，至50 mL量瓶中，加乙醇超声溶解并定容至刻度，精密量取1.00 mL，置10 mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，加氢氧化钠试液4.0 mL，摇匀，静置15 min后加水至刻度，摇匀，依法测定吸光度。用标准曲线法求得供试品溶液中黄酮类化合物的重量。

3　结果与讨论

3.1结果

表1　山楂叶总黄酮不同制备方法及含量测定结果Table 1　The results of the different preparation methods and content determination of total flavonoids in Hawthorn leaves

3.2讨论

本实验比较了不同提取、分离方法所制备的四组产品的产率，结果以超声法提取、萃取法分离得到的样品产率和含量最高，经过小组讨论，可能的原因有：

(1) 提取方法的影响：产率和含量比较超声法>渗漉法。渗漉提取法适合根茎类药材的提取，对于茎叶类药材的提取效果相对较差。

(2)分离方法的影响：产率和含量比较萃取法>树脂法。树脂法所得样品的产率和含量主要取决于上样量、树脂的型号、洗脱溶剂的极性和体积，由于没有对树脂分离条件进行探究，所选的实验条件对结果可能有影响。

(3)含量测定方法：本实验采用2015版《中国药典》一部“山楂叶”项下收载的紫外分光光度法对制备的山楂叶总黄酮样品进行含量测定，该方法操作简单，但专属性较差，不能反映其中化学成分的情况。下一步会考虑采用HPLC-MS等专属性更强的分析方法探明山楂叶总黄酮中化学成分种类及含量。

(4)参数优化：由于课时的限制，我们未能对提取溶剂的极性、体积等因素进行系统的探究。在之后的实验教学中，可以考虑针对相关参数的优化进一步完善实验设计。

4　结　语

山楂叶总黄酮提取及制备的自主设计性实验历时近六周，通过实验方案的反复修订、突发问题的分析处理，我们的实验技能、团队协作、专业素养都得到了提升。在实践中及时的发现问题、辩证的分析问题、灵活的解决问题是我们这次实验的最大收获。在今后的学习中会我们更加注重自身能力的培养，不断完善自我以适应未来药学工作的需要。

[1]朱兰寸,金萍.天然药物化学实验模块实训与操作技能的培养[J].中国中医药现代远程教育,2015,13(14):86-88.

[2]阎婷,于玲.天然药物化学实验教学中创新理念的应用[J].辽宁医学院学报,2014,12(4):73-75.

[3]中华人民共和国药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:32.

[4]韩晓璐,刘悦,闻俊,等.药学本科药物分析自主设计性实验的实践探索[J].广州化工,2014,42(15):230-232.

[5]于栋华,包顺茹,于纯淼,等.山楂叶总黄酮药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2013,15(3):174-176.

[6]夏成凯,李静,汪电雷.山楂叶总黄酮制备工艺参数的研究[J].长江大学学报,2014,11(3):78-81.

[7]兰才.山楂叶总黄酮含量测定[J].现代医药卫生,2013,29(9):1382.

[8]焦镭,柴梦颖,石明生,等.碱性条件下山楂叶总黄酮的提取工艺研究[J].北方园艺, 2014(8):128-130.

[9]任艳利,张维,刘影.准噶尔山楂叶总黄酮的超声波提取及抗氧化研究[J].安徽农业科学,2012,40(15):8710-8712.

[10]王肖,杜义龙,赵胜男,等.承德产山楂叶中总黄酮和5种黄酮类成分含量的动态分析[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(17):171-175.

[11]孙君凯,王帅,包永睿,等.山楂叶黄酮类成分提取纯化工艺研究[J].辽宁中医药大学学报,2014,16(6):110-112.

[12]郑赛利,许先芳,李莲云,等.阿戈美拉汀的晶型制备表征及性质研究——药物多晶型综合设计性实验[J].实验技术与管理,2015,32(2):58-60.

Practice of Autonomous-designed Experiment of Natural Product Chemistry*

WANG Zheng1, LI Chun-yan1, LIU Wei1, DONG Zhong-yun1, SHEN Song-zhang2, SU Juan2

(1 Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433;2ExperimentalTeachingCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

In order to help students to understand and practice the preparation and content determination of active extracts in natural products, an autonomous-designed experiment about total flavonoids in Hawthorn Leaves was implemented in Natural Product Chemistry teaching course. Students were divided into several groups to retrieve literatures, design the protocol and improve it with the teacher’s guide. After accomplishing the whole experiment including the preparation and content determination of total flavonoids in Hawthorn Leaves, the data was analyzed and came to a conclusion of the assay. Some suggestions were given on improving the quality and qualification of active extracts. In the end, the procedures of the designed experiment were summarized an discussed．

Natural Product Chemistry; autonomous-designed experiment; Hawthorn Leaves; preparation; content determination

中国高等教育学会药学教育研究会资助课题(201419)。

王政(1995-)，男，药学本科2013级学员。

苏娟(1979-)，女，博士，副教授，主要从事中药化学科研和教学工作。

R284

B

1001-9677(2016)014-0180-03