克雷伯氏菌NY1产絮凝剂的阳离子修饰研究

聂红云,聂麦茜,白雪蕊,赵 璇,宋勃轩



克雷伯氏菌NY1产絮凝剂的阳离子修饰研究

聂红云,聂麦茜*,白雪蕊,赵 璇,

(西安建筑科技大学环境与市政工程学院,陕西 西安 710055)

为简化微生物絮凝剂投加步骤,消除由于助凝剂添加而引起的环境二次污染问题,以3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CTA)修饰荷负电的微生物絮凝剂(~-54mV),从而获得荷正电的改性絮凝剂.实验结果显示,CTA与NaOH的摩尔比值是影响阳离子修饰效果的主要因素;阳离子修饰的的最佳条件为:10g微生物絮凝剂, 0.015mol CTA,20%含水率,CTA与NaOH的摩尔比为0.95,80℃反应2h后.在最佳条件下所得阳离子化微生物絮凝剂的Zeta电位可达+16mV,其对高岭土的絮凝率也由阳离子化前的60.5%上升至91%.由阳离子化絮凝剂的结构表征可知,阳离子修饰过程并未改变微生物絮凝剂的根本结构,只是在原微生物絮凝剂基础上引入阳离子基团,从而增加了絮凝剂整体分子量;同时,由于阳离子基团的大量引入,絮凝剂的结晶度增加,从而使其溶解度增加.将阳离子化前后微生物絮凝剂应用于去除铜绿微囊藻,当阳离子化后微生物絮凝剂添加量为40mg/L时,其对藻类的去除率超过98%;而未阳离子修饰的微生物絮凝剂对该藻几乎没有去除效果.

3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CTA)；微生物絮凝剂；阳离子修饰

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝活性的代谢产物[1-3].因其高效、无毒、无二次污染以及用途广泛等优势而成为研究热点.微生物直接分泌的具有絮凝活性的物质均荷负电,需Ca2+、Mg2+等阳离子或聚合氯化铝等作助凝剂,以提高其水处理的效率和活性[4-7].这将导致沉降污泥和处理后水样中残留较高Ca2+、Mg2+或Al3+,易引起二次污染,且应用时须与助凝剂分别投加,致使操作步骤繁琐.微生物絮凝剂阳离子化修饰是解决该问题的途径之一.目前,生物大分子阳离子化研究主要集中在淀粉[8-9]、纤维素[10-12]、壳聚糖等多糖类天然产物.糖蛋白或蛋白类因分子中官能团和空间结构复杂,易变性,目前尚未见糖蛋白絮凝剂阳离子化的相关报道.本文以阳离子醚化剂修饰糖蛋白类微生物絮凝剂,使修饰后的絮凝剂分子荷正电,旨在提高其活性及其实用性,为微生物絮凝剂工业化提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:克雷伯氏菌NY1为课题组前期从污水处理厂污泥中分离筛选而得[13].

种子液培养基:3g牛肉膏,10g蛋白胨和5g NaCl,溶于800mL蒸馏水,pH值调至7.5,并用蒸馏水定容至1000mL,灭菌备用.

发酵培养基:20g蔗糖, 2.12g NaNO3,0.4mL 1mol/L MgSO4溶液,0.1mL 1mol/L CaCl2溶液,磷酸盐缓冲溶液25mL,1mL微量元素溶液,并用蒸馏水定容至1000mL,灭菌备用.

1.2 方法

1.2.1 克雷伯氏菌NY1发酵产絮凝剂 无菌条件下,从NY1菌保存平板上挑取单克隆于100mL灭菌的种子液培养基中.将该体系于31℃, 150r/min恒温振荡培养16h得种子液.在无菌工作台中,将该种子液按2%接种量接种于发酵培养基中.于31℃,150r/min恒温发酵72h.

1.2.2 微生物絮凝剂的提取及纯化 将克雷伯氏菌NY1 72h后的发酵液于4℃,8000r/min离心15min,弃菌体,上清液按照体积比为1:3与无水乙醇混合,摇匀后静置.离心,倾去上清液,即得微生物絮凝剂粗品[14].

将絮凝剂粗品溶于少量蒸馏水,再次用无水乙醇沉淀,反复3次,即得絮凝剂纯品.

1.2.3 微生物絮凝剂的阳离子修饰 阳离子修饰微生物絮凝剂的反应采取L16(45)正交试验进行优化,各因素水平见表1,具体实验安排见表2.反应过程如下:将3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CTA)与NaOH水溶液按一定比例进行混合,搅拌使其反应10min.然后加入10g NY1菌所产絮凝剂纯品,于室温下搅拌1h,放入恒温箱中反应数小时.反应完毕后,于反应体系中加入少量蒸馏水使其完全溶解,按1:3比例加入无水乙醇反复萃取3次,8000r/min离心,将所得固体于60℃下干燥,即得阳离子修饰后的微生物絮凝剂.

表1 阳离子化反应正交L16(45)因素水平Table1 Factors and levels of Orthogonal L16 (45) for cationization

注: A、B、C、D、E分别为:阳离子醚化剂用量、阳离子醚化剂与NaOH用量摩尔比值、反应时间、反应温度以及含水率.

1.2.4 絮凝活性的测定 将0.4mL阳离子修饰微生物絮凝剂(1g/L)加至50mL 2g/L的高岭土悬浊液(pH=7.5)中,或将0.2mL未阳离子修饰微生物絮凝剂(2g/L)和0.2mL的浓度为1mol/L CaCl2溶液依次加入50mL 2g/L的高岭土悬浊液(pH=7.5)中,快速搅拌1min,慢速搅拌2min,然后静置5min,测定上清液吸光度OD550nm.絮凝率计算公式为:

絮凝率(%) = [(-) /]´100% (1)

式中:为絮凝剂加入前高岭土悬浊液在550nm处的吸光度;为混凝后上清液在550nm处的吸光度.

1.2.5 阳离子修饰后絮凝剂的结构表征 絮凝剂Zeta电位测定:将纯化后的絮凝剂配制成50mg/L的溶液,多次测量其电位,然后取平均值.

絮凝剂粒径分布测定:取1mL 5g/L纯化后的絮凝剂水溶液,用激光粒度分布测定仪对絮凝剂溶液粒径分布进行测定.

红外光谱分析:取约20mg絮凝剂样品,与KBr混匀压片后,使用傅里叶红外光谱分析仪测定红外光谱.

扫描电镜:将纯化后的阳离子修饰絮凝剂研磨成粉末,置于样品柱上喷金(Bal-Tec SCD005Sputter Coater),然后在JSM 6510LV 扫描电镜上进行表面扫描.

1.2.6 阳离子化微生物絮凝剂对高藻水中藻类的絮凝去除 将一定量的阳离子修饰微生物絮凝剂(1g/L)加至高藻水中,或将0.2mL未阳离子修饰微生物絮凝剂(2g/L)和0.2mL的浓度为1mol/L CaCl2溶液依次加至高藻水中,快速搅拌1min,慢速搅拌2min,然后静置5min,于液面下3cm 处取样.以藻类分析仪测定絮凝前后藻类浓度,计算絮凝率.絮凝率计算公式为:

絮凝率(%) = [(1-2)/1]´100% (2)

式中:1为絮凝剂加入前藻类浓度;2为絮凝剂加入后藻类浓度.

2 结果与讨论

2.1 阳离子化正交实验结果

由表3可知,各因素的极差排列顺序为RB> RA>RC>RE>RD,由此可知,各反应因素对阳离子修饰效果的影响大小顺序为:“阳离子醚化剂/NaOH”摩尔比>阳离子醚化剂用量>反应时间>含水率>反应温度,最佳反应条件组合为A1B4C4D4E4.因此,对于10g微生物絮凝剂,当CTA为0.015mol,CTA与NaOH的摩尔比为0.95,含水率为20 %时,于80 ℃反应时间2h后,所得阳离子化微生物絮凝剂对SS的去除率最佳,其单独使用时,对含2g/L高岭土水中的SS去除率可达91 %.

表3 阳离子化反应正交L16(45)实验数据结果Table 3 Data analysis of cationization obtained by orthogonal L16 (45)

注:a表示反应未进行.

2.2 阳离子化对絮凝剂Zeta电位及活性的影响

如图1所示,阳离子修饰大大改变了微生物絮凝剂Zeta电位及其絮凝活性.微生物絮凝剂的平均Zeta电位为-50.2mV,在添加助凝剂条件下,其对2g/L的高岭土悬浊液的最佳絮凝效率为60.5%;阳离子后,改性絮凝剂Zeta电位提高至+16.5mV,在无助凝剂且投加量相同的条件下,其对高岭土悬浊液的絮凝效率上升至91 %.该结果说明,上述正交试验已成功将微生物絮凝剂阳离子化,使其荷正电.

2.3 阳离子化对NY1菌所产糖蛋白絮凝剂分子结构的影响

图2中3650~3000cm-1宽而强的谱带是缔合的—NH/—OH伸缩振动吸收峰,~2920cm-1处弱的吸收带为C—H不对称伸缩振动吸收峰,1640, 1535,1400cm-1吸收峰为蛋白质中酰胺基的Ⅰ谱带 (C—O伸缩振动)、酰胺Ⅱ谱带(N—H弯曲与C—N伸缩振动叠加)和酰胺Ⅲ谱带(C—N伸缩振动),结合前期絮凝剂组成测定结果[15]可知,阳离子化前后,微生物絮凝剂分子中糖蛋白的主要官能团并未发生大的变化.然而,阳离子化后絮凝剂红外谱图中,~1480cm-1处的吸收峰明显增强,400~900cm-1处的吸收谱带变宽,该两处吸收峰为阳离子醚化剂的特征吸收峰.因此,红外光谱结果进一步证明阳离子修饰反应成功将阳离子醚化剂引入微生物絮凝剂中.

2.4 阳离子化对NY1菌所产糖蛋白絮凝剂粒径分布的影响

由图3可知,阳离子化前后,絮凝剂粒径分布变化较大.粒径在1.26~111μm 和133.7~339.9μm范围内的絮凝剂,阳离子化前,分别占絮凝剂总体积的72.9%和24%;阳离子化后,分别占絮凝剂总体积的61.7%和33.3%.因此,阳离子化后,絮凝剂的粒径分布向大粒径方向移动.这也说明阳离子修饰过程并未从破坏原有微生物絮凝剂的整体结构,只是在原有微生物絮凝剂的基础上引入阳离子基团.

2.5 阳离子化对NY1菌所产糖蛋白絮凝剂表面形貌的影响

由图4看,阳离子修饰前后絮凝剂表面形态有较大的变化.阳离子修饰之前,絮凝剂为不规则、无定型状结构,说明克雷伯氏菌NY1所产絮凝剂为无定型的大分子,与前期研究结果一致[15].阳离子修饰之后,絮凝剂呈八面体结晶状,这与分子中引入大量阳离子基团有关.阳离子修饰后,絮凝剂整体的离子强度增加,结晶度增加,从而使其溶解度大大提高.阳离子修饰前,干燥的微生物絮凝剂溶解缓慢,较难溶,一般需要浸泡过夜才能完全溶解,有时甚至需要加热;而阳离子修饰后,絮凝剂加水即溶,更易以溶液形式投加,从而方便了絮凝剂的应用.

2.6 阳离子化对NY1菌所产糖蛋白絮凝剂去除铜绿微囊藻的影响

由图5结果看,阳离子化前的微生物絮凝剂对铜绿微囊藻几乎没有去除效果,其最大去除率为10%;而阳离子化后的微生物絮凝剂对铜绿微囊藻的去除率随其添加量的增加而增加,在其终浓度为40mg/L时,对藻类的去除率超过98%.

3 结论

3.1 根据正交实验极差结果可知,各反应因素影响大小的排序为:阳离子醚化剂与NaOH用量摩尔比值>阳离子醚化剂用量>反应时间>含水率>反应温度,其中阳离子醚化剂与NaOH用量摩尔比值为主要影响因素.

3.2 微生物絮凝剂阳离子化最优条件为:每10g絮凝剂中需加入阳离子醚化剂0.015mol,阳离子醚化剂与NaOH用量摩尔比值为0.95,反应时间2h,反应温度80℃,含水率20%,单独添加在该条件下合成的新型絮凝剂,其对2g/L的高岭土的去除率可达91%.

3.3 阳离子修饰后,微生物絮凝剂的Zeta电位大幅度增加,从荷负电提升为荷正电,絮凝活性亦提高.阳离子修饰并未改变微生物絮凝剂根本架构,只是在原微生物絮凝剂结构基础上引入阳离子基团,从而增加了絮凝剂整体分子量,有利于混凝过程中絮体的快速沉降.大量阳离子基团引入,增加了絮凝剂的结晶度与溶解度,方便了絮凝剂的应用.

3.4 阳离子化前微生物絮凝剂对铜绿微囊藻几乎没有去除效果;而阳离子化后的微生物絮凝剂对该藻的去除率随其添加量的增加而增加,在其终浓度为40mg/L时,对藻类的去除率超过98%.

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* 责任作者, 教授, niemaiqian@xauat.edu.cn

Cationization of microbioflocculants produced bysp. NY1

NIE Hong-yun, NIE Mai-qian*, BAI Xue-rui, ZHAO Xuan, SONG Bo-xuan

(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China)., 2016,36(6)：1788~1793

To simplify the dosing steps of microbioflocculants and eliminate the secondary pollution arising as the using of flocculation aid, 3-chloro-2-hydroxy-propyl-trimethyl ammonium chloride (CTA) was employed to modify the negatively charged microbioflocculants (~-54mV) so as to obtain the positively charged cationized flocculants in this paper. The results showed that the mole ratio of CTA/NaOH was the major influence factor for successful cationization of microbioflocculants. Optimal cationization conditions of microbioflocculants were:10g microbioflocculants, 0.015mol CTA, the mole ration of CTA/NaOH=0.95 and 20% (m/m reaction system) water, reacting at 80℃ for 2h. Under the optimal conditions, Zeta potential of the obtained cationized flocculants reached +16mV, flocculating activity of the obtained cationized flocculants increased from 60.5% which was the maximum flocculating activity of the unmodified microbioflocculants to 91%. Characterization results of the cationized flocculants showed that, the cationized group has indeed introduced into the original microbioflocculant during the cationization reactions, but did not change its carbon skeleton structure, so the ratio of the large molecular weight in the cationized flocculants is increased. And meanwhile the large amount of cationized group increased the crystalline and the solubility of the modified flocculants. The modified flocculants could also be applied for removing microcystis aeruginosa, and its removing rate could exceed 98% when the concentration of cationized microbioflocculants was 40mg/L, while the unmodified microbioflocculants have no effect on the removing of microcystis aeruginosa.

3-chloro-2-hydroxy-propyl-trimethyl ammounium chloride (CTA)；microbioflocculants；cationization

X703

A

1000-6923(2016)06-1788-06

聂红云(1983-),女,陕西大荔人,西安建筑科技大学博士研究生,主要从事微生物降解及胞外分泌物的研究.发表论文6篇.

2015-12-05

国家自然科学基金资助项目(51278405);陕西省重点科技创新团队建设计划(2013KCT-13)