混料设计法优化红枣汁乳酸发酵菌种配比研究

赵丛枝，范改敬，梁爽，张子德（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

混料设计法优化红枣汁乳酸发酵菌种配比研究

赵丛枝，范改敬，梁爽，张子德*
（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

以红枣发酵液的乳酸含量和活菌数为指标，选择嗜酸乳杆菌（NCFM）、干酪乳杆菌（D400）、植物乳杆菌（121）和嗜热链球菌（St）作为发酵菌种，利用混料设计法优化菌种配比。建立了各菌种配比与发酵液活菌数和乳酸含量的数学回归模型，并对此进行分析和预测，得出各菌种最佳体积比为：干酪乳杆菌（D400）∶嗜酸乳杆菌（NCFM）∶植物乳杆菌（121）=1∶1∶2，此时活菌数为1.81×109CFU/mL，乳酸含量为6.31 g/L。

混料设计；红枣汁；乳酸菌；发酵

红枣（Ziziphus jujube Mill）别名大枣、刺枣、胶枣等，是鼠李科枣属植物的成熟果实。红枣原产于我国，现在已有3 000多年的种植历史，与李、杏、桃、栗并称为中国的“五果”[1]。目前，我国红枣种植主要集中在河北、山东、陕西、新疆、山西、河南、辽宁、甘肃、宁夏和天津等地[2-3]，红枣品种共有700多个，其中重要的品种有金丝小枣、阿克苏红枣、若羌灰枣、和田玉枣、陕北有机红枣、临泽小枣、柳林木枣以及河北的赞皇大枣等。

红枣的营养成分含量很高，所以有“木本粮食，滋补佳品”的称号。近代研究发现，红枣中还含有丰富的生理活性成分[4-6]，如红枣多糖、酚类物质、三萜类物质、环核苷酸、皂苷、生物碱等，多食用红枣能够起到补气养血、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、保护肝脏、软化血管、降血压等功效。

中国是红枣的原产地，也是红枣出口大国，但就目前而言，红枣粗加工产业居多，产品附加值低，技术含量低，规模较小，所以今后红枣加工应向精深加工迈进，不断提高技术水平，提高原料利用率减少损耗，降低成本从而增加红枣的经济效益。

利用乳酸菌制作发酵乳制品在全世界范围内都具有悠久的历史，但近些年来在其他食品原料加工中的应用越来越多。果汁经过乳酸菌发酵后，不仅可以提高营养价值，还能产生清爽的口感。混料设计是研究配料中各组分比例的试验设计方法，应用于多种领域，近年来在食品工业上的应用越来越广泛[7-9]。本试验利用混料设计法，优化红枣汁乳酸发酵菌种的配比，以得到红枣汁乳酸发酵剂中各菌种的最佳组合。

1　材料与方法

1.1材料

红枣：试验所用红枣品种为和田玉枣，市售，干枣，无霉烂。

菌种：试验所选8株乳酸菌均来自于河北农业大学微生物实验室，分别为嗜热链球菌（St）、嗜酸乳杆菌（NCFM）、干酪乳杆菌（Y5-2b）、干酪乳杆菌（D400）、植物乳杆菌（121）、保加利亚乳杆菌（Lb）、德氏乳杆菌（5MI）、鼠李糖乳杆菌（lackid）。

1.2试剂与设备

1.2.1试验试剂

果胶酶、纤维素酶：江苏锐阳生物科技有限公司。

1.2.2仪器与设备

生化培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；pB-10 型pH计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；AR423CN电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司制造；THZ-82电子恒温水浴振荡器：江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司；SW-CJ-1D型超净工作台：苏州净化设备有限公司；JYL-C012料理机：九阳股份有限公司。

1.3试验方法

1.3.1红枣汁的制备

取一定量的红枣蒸煮5 min后，加入6倍的水进行打浆，于80℃下浸提90 min，按照重量比加入果胶酶∶纤维素酶=2∶1的混合酶0.16%，于50℃酶解2.1 h。将枣汁分装试管，于121℃下灭菌15 min用于乳酸菌的驯化和活化；将枣汁分装在锥形瓶中，于85℃下灭菌15 min用于乳酸菌发酵。

1.3.2发酵菌种的驯化及确定

1.3.2.1发酵菌种的驯化

由于所用的8株乳酸菌均不是来自红枣，所以在接入纯枣汁之前，需要对乳酸菌进行梯度驯化，以便使其逐步适应纯枣汁的营养条件。具体做法为，先将所用菌种用复原乳培养基进行活化，然后逐步接入体积比为纯枣汁∶复原乳=1∶9、3∶7、6∶4、8∶2、10∶0的复合培养基中，37℃条件下培养17 h。

1.3.2.2发酵菌种的确定

将驯化好的8株乳酸菌按照4%的接种量分别接种到纯枣汁中，在37℃恒温箱中培养17 h后测定最终红枣汁的活菌数和产酸量（以乳酸计），选出3株～5株发酵性能较好的菌株。

选取4株发酵性能较好的菌株，借助试验设计软件Design-Expert8.0.6，采用混料设计中的单纯形重心设计[10-12]，以发酵后的活菌数和产酸量（以乳酸计）为响应值，优化发酵菌种的配比，试验因素水平如表1。

1.3.4试验指标测定方法

1）总酸的测定：GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》，并换算为乳酸含量；

表1　试验因素水平表Table 1　Factors and levels ofexperiment

2）活菌数的测定[13]：采用平板菌落计数法，于37℃下培养48 h。

2　结果与分析

2.1发酵菌种的确定

不同乳酸菌发酵结果见表2。

表2　乳酸菌发酵后活菌数及乳酸产量Table 2　The living bacteria number and acid yield after fermentation

由表2可知，8株乳酸菌在纯枣汁中均可发酵产酸，这是因为8株菌都可以利用红枣中所含的葡萄糖和果糖进行发酵，嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌还可以利用红枣中含有的少量蔗糖。发酵结果表明，8株菌发酵后活菌数均可达到106CFU/mL以上，乳酸含量差别较大。

在教授的过程中，教师通过解决问题来解释数学思想，数学应用方法解决了数学问题.老师反映思维活动，学生掌握了以自己的逻辑思维生活的能力，发现数学的乐趣，找到解决问题的最佳解决方案.教学问题解决过程通过分析向学生讲授课程的方法.通过不断的学习，总结和理解数学思维方法.在高中数学教育过程中，教师需要通过教授学生的知识和技能，有效地提高学生的学习效率，并将数学思想无形地嵌入学生中.

其中，嗜酸乳杆菌NCFM在纯枣汁中发酵后活菌数和乳酸含量最高，分别达到1.20×109CFU/mL和4.97 g/L，显著高于其他菌株。干酪乳杆菌D400、植物乳杆菌121和嗜热链球菌St三株菌发酵后活菌数都达到了108CFU/mL以上，相互之间差异显著（P＜0.05），乳酸含量均在4.4 g/L以上。另外上述4种菌属于不同菌种，在发酵纯枣汁过程中可以表现出不同的发酵特性，充分利用红枣中的营养成分，得到更好的产品，所以本试验选取嗜酸乳杆菌（NCFM）、干酪乳杆菌（D400）、植物乳杆菌（121）和嗜热链球菌（St）作为发酵菌种。

2.2发酵菌种配比的优化研究

2.2.1混料设计优化结果

以A（St嗜热链球菌）、B（D400干酪乳杆菌）、C （NCFM嗜酸乳杆菌）和D（121植物乳杆菌）为自变量，总接种量为4%，以乳酸含量和活菌数为因变量，混料设计试验方案及结果见表3。

表3　混料设计方案及结果Table 3　Program and resultofmixture design

2.2.2乳酸含量和活菌数模型的建立及方差分析

通过统计分析软件Design-Expert.V8.0.6对试验结果进行数据分析，分别建立活菌数R1和乳酸含量R2的回归模型方程如下：

R1=1.189×108A+3.604×108B+5.771×108C+2.170× 108D+2.108×109AB+3.421×109AC+2.238×109AD+4.996× 109BC+4.785×109BD+2.828×109CD；

R2=4.46A+4.69B+4.87C+4.58D+2.23AB+4.16AC+ 2.47AD+5.29BC+5.32BD+3.35CD

活菌数方差分析结果见表4。

由表4可知该模型回归显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.275 7）。该模型方程的确定系数R12=0.973 2，校正后R1Adj2=0.956 0，说明该模型能很好的拟合红枣汁发酵液活菌数与菌种配比的关系。通过F值和P值可知，4个因素之间交互作用显著，并且作用大小为BC＞BD＞AC＞CD＞AB＞AD，即B（D400干酪乳杆菌）和C （NCFM嗜酸乳杆菌）的交互作用对活菌数影响最显著。

表4　活菌数回归方程的方差分析表Table 4　ANOVA for regression equation ofliving bacteria number

乳酸含量方差分析结果见表5。

表5　乳酸含量回归方程的方差分析表Table 5　ANOVA for regression equation of acid yield mode

由表5可知该模型回归显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.209 7）。确定系数R22=0.987 3，校正后R2Adj2=0.979 1，说明该模型能很好的拟合红枣汁发酵液乳酸含量和菌种配比的关系。通过F值和P值可知，4个因素之间交互作用显著，并且作用大小为BD＞BC＞AC＞CD＞AB＞AD，乳酸含量与活菌数方差分析结果一致，即B（D400干酪乳杆菌）和D（121植物乳杆菌）的交互作用对活菌数影响最显著。

2.2.3乳酸含量和活菌数模型交互项的响应曲面图分析

混料设计中，各因素的变化及相互作用对结果的影响可以从等高线图和曲面图中看出，在本试验中固定其中一个因素，可以比较其他因素的变化对红枣汁发酵液的乳酸含量和活菌数的影响。图1为菌种D（121植物乳杆菌）固定时，A（St嗜热链球菌）、B（D400干酪乳杆菌）、C（NCFM嗜酸乳杆菌）对红枣汁发酵液活菌数的影响；图2为菌种A（St嗜热链球菌）固定时，B（D400干酪乳杆菌）、C（NCFM嗜酸乳杆菌）和D（121植物乳杆菌）对红枣汁发酵液活菌数的影响。图3为菌种D （121植物乳杆菌）固定时，A（St嗜热链球菌）、B（D400干酪乳杆菌）、C（NCFM嗜酸乳杆菌）对红枣汁发酵液乳酸含量的影响；图4为菌种A（St嗜热链球菌）固定时，B（D400干酪乳杆菌）、C（NCFM嗜酸乳杆菌）和D（121植物乳杆菌）对红枣汁发酵液乳酸含量的影响。

图1　菌种A、B、C对活菌数影响的等高线和曲面图Fig.1　Response surface plotand contour plot of the effect ofbacterial A，B，C on living bacteria number

图2　菌种B、C、D对活菌数影响的等高线和曲面图Fig.2　Response surface plot and contour plotofthe effect of bacterial B，C，D on living bacteria number

图3　菌种A、B、C对乳酸含量影响的等高线和曲面图Fig.3　Response surface plot and contour plotofthe effectof bacterial A，B，C on lactic acid yield

图4　菌种B、C、D对乳酸含量影响的等高线和曲面图Fig.4　Response surface plot and contour plotofthe effectof bacterial B，C，D on lactic acid yield

由图1～图4可知，等高线图均为椭圆形，所以4种菌的交互作用对活菌数和乳酸含量有显著影响。分析图1、图2可知，随着D400干酪乳杆菌比例的增加，活菌数增加较快，所以干酪乳杆菌对活菌数的影响最大，当其水平为0.462时，活菌数有最大预测值1.816 2× 109CFU/mL。121植物乳杆菌、NCFM嗜酸乳杆菌对活菌数也有显著影响，St嗜热链球菌对其影响最小。分析图3、图4可知，D400干酪乳杆菌对乳酸含量的影响最大，其水平为0.400时，乳酸含量有最大预测值6.292 15 g/L。121植物乳杆菌、NCFM嗜酸乳杆菌对乳酸含量也有显著影响，St嗜热链球菌对其影响最小。

2.2.4验证试验

利用软件的最优化功能得到了28个菌种配比和预测值，如表6所示。

表6　菌种配比及预测结果Table 6　Proportions of bacterium and predicted results

续表6 菌种配比及预测结果Continue table 6　Proportions ofbacterium and predicted results

从中选取了响应值较高的一组，当A（St嗜热链球菌）∶B（D400干酪乳杆菌）∶C（NCFM嗜酸乳杆菌）∶D （121植物乳杆菌）=0.000∶0.400∶0.358∶0.243时，活菌数和乳酸含量最高，分别为1.82×109CFU/mL，6.29 g/L。为了方便操作调整为B∶C∶D=1∶1∶2，进行了5次验证试验，得到活菌数为1.81×109CFU/mL，乳酸含量为6.31 g/L，与预测结果基本一致，所以软件得到的结果具有实际意义。

3　结论

本试验以红枣发酵液的乳酸含量和活菌数为指标，确定了发酵菌种为嗜酸乳杆菌（NCFM）、干酪乳杆菌（D400）、植物乳杆菌（121）和嗜热链球菌（St）。利用混料设计优化菌种配比，得出R1乳酸含量和R2活菌数对A（St嗜热链球菌）、B（D400干酪乳杆菌）、C （NCFM嗜酸乳杆菌）和D（121植物乳杆菌）回归模型如下：

R1=1.189 8×108A+3.604×108B+5.771×108C+2.170× 108D+2.108×109AB+3.421×109AC+2.238×109AD+4.996×109BC+4.785×109BD+2.828×109CD；

R2=4.46A+4.69B+4.87C+4.58D+2.23AB+4.16AC+ 2.47AD+5.29BC+5.32BD+3.35CD

对此进行分析和预测，得出最佳配比为干酪乳杆菌（D400）∶嗜酸乳杆菌（NCFM）∶植物乳杆菌（121）=1∶1∶2，此时活菌数为1.81×109CFU/mL，乳酸含量为6.31g/L。

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Application of Mixture Design in Study of Lactobacillus Proportion in Jujube Juice Fermentation

ZHAO Cong-zhi，FAN Gai-jing，LIANG Shuang，ZHANG Zi-de*
（College ofFood Science and Technology，Agricultural University ofHebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Viable count and lactic acid content was chosed as indicators，then selected Lactobacillus acidophilus（NCFM），Lactobacillus casei（D400），lactobacillus plantarum（121）and Streptococcus thermophilus （St），Mix design optimization was used to determine the optimal lactobacillus proportion in Jujube Juice fermentation.The regression mathematicalmodels ofthe factors on viable countand lactic acid contents were built. The optimum volume ratio were D400∶NCFM∶121=1∶1∶2，and the viable countatthis condition was 1.81× 109CFU/mL，lactic acid contentwas 6.31 g/L.

mixture design；jujube juice；lactic acid bacteria；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.023

赵丛枝（1978—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品科学与工程。

张子德，男（汉），教授，研究方向：农产品贮藏与加工。

2016-01-20