响应面法优化超声辅助提取夏枯草多糖工艺

赵志刚，宣丽英，李志英，高瑞苑，张海容（忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000）

响应面法优化超声辅助提取夏枯草多糖工艺

赵志刚，宣丽英，李志英，高瑞苑，张海容*
（忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000）

通过响应曲面法优化超声提取夏枯草中多糖类化合物的工艺，在单因素试验的基础上，选择提取功率、提取温度、提取时间、液固比和提取次数5个因素，利用Box-Benhnken中心组合试验和响应面分析法，研究了各自变量交互作用及其对夏枯草多糖产率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明：夏枯草中多糖类化合物的最佳超声辅助提取工艺为：提取功率90 W、提取温度65℃、液固比40∶1（mL/g）、时间52 min、提取次数两次，夏枯草中多糖类的实测结果（4.60%）与响应面拟合方程的预测值（4.64%）符合良好。

夏枯草；响应面法；多糖；超声辅助提取

夏枯草（Prunella vugaris L.）为唇形科夏枯草属植物，多年生草本，为常用中药。主要生长于疏林、荒山、田埂及路旁，花期4月～6月，果期7月～10月。由于此草夏至后即枯，故有此名，主产于江苏、安徽、浙江、河南等省。夏枯草性寒，味甘、辛、微苦，具有清泄肝火、明目、清热解毒、祛痰止咳、凉血止血、利尿的功效。现代药理研究表明，夏枯草有降低血压的作用。夏枯草的干燥果穗和全草均可入药也可制作美味佳肴[1-3]。夏枯草含有多种活性化学成分，其中多糖具有抗菌、降压、消炎、抗肿瘤、降血糖等独特的药理功能[4-6]，在临床方面具有独特的应用前景。

文献中关于夏枯草的药理研究、栽培、化学成分、产品开发等及夏枯草中多糖的提取技术已有不少报道，但有关响应面优化-超声辅助提取夏枯草中多糖的技术鲜见报道。多糖是夏枯草中的重要活性成分，本试验针对夏枯草多糖具有抗肿瘤、抗病毒等药理作用，研究夏枯草中多糖的提取方法，应用硫酸-苯酚法测定夏枯草中多糖的含量，为夏枯草的进一步研究和开发利用提供科学参考。

1　仪器与材料

1.1材料及试剂

夏枯草：产地江苏，购自忻州市老药工药店，恒温50℃烘干，粉碎过60目筛，保存备用；葡萄糖（分析纯）：北京化学试剂公司；苯酚（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；浓硫酸（98%）：天津市耀华化学试剂有限公司。

1.2试验仪器

Al204型电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ3200DV型数控超声波清洗器：超声功率150 W，超声频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司；723型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司。

2　方法

2.1工作曲线和回归方程

用移液管分别移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL100μg/mL的葡萄糖标准溶液于9支比色管中，用二次蒸馏水补充至2 mL，加5%的苯酚溶液各1 mL，再加98%的浓硫酸各5 mL，静置0.5 h、冷却至室温，在最大吸收波长490 nm处，以试剂空白为参比，测定吸光度值，并以吸光度值A为纵坐标，浓度C （μg/mL）为横坐标绘出标准曲线，回归方程为A= 0.047 6C-0.023 3，R2=0.996 8。

2.2样品中多糖化合物含量的测定

准确称取样品0.200 0 g于试管中，超声提取后，抽滤，定容至100 mL容量瓶中，摇匀。移取25 mL于50 mL的容量瓶中进行稀释2倍，然后从50 mL容量瓶中移夏枯草中多糖类化合物的产率。

多糖产率/%=C×D×f÷W×100

式中：C为供试液中葡萄糖浓度，mg/mL；D为多糖的稀释因素，mL；f为换算因子；W为供试夏枯草样品的重量，mg。

2.3响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken的中心组合设计原理，4个主要因素超声功率、超声温度、液固比和超声时间分别用A、B、C、D、来表示，每一个自变量的低、中、高试验水平分别以-1、0、+1进行编码。试验因素与水平设计见表1。

表1　试验因素水平及编码Table 1　Experimentalfactors leveland coding

3　结果与分析

3.1单因素试验

3.1.1超声功率对多糖产率的影响

在提取温度为65℃，提取时间为30 min，液固比为40∶1（mL/g），研究超声波功率在60 W～150 W时对多糖产率的影响，结果见图1。

图1　超声功率对多糖产率的影响Fig.1　The influence of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide

由图1可知随超声波功率的增加，产率提高，直到超声波功率达到90 W时，产率达到最大，再增加超声功率，产率反而会有所下降，最后达到稳定。因此，从节能的角度考虑，在响应曲面优化试验中，选90 W左右为最佳。

3.1.2超声温度对多糖产率的影响

提取功率为90 W，提取时间为30 min，液固比为40∶1（mL/g），研究超声温度对产率的影响，结果见图2。

图2　超声温度对多糖产率的影响Fig.2　The influence of ultrasonic temperature on extraction yield ofpolysaccharide

由图2可知，随着温度的升高产率增大，直至达到稳定。当温度为65℃时，多糖的产率最大。所以选65℃左右为最佳。

3.1.3液固比对多糖产率的影响

提取温度为65℃，提取时间为30 min，超声波功率为90 W，研究液固对多糖产率的影响，结果见图3。

由图3可知随着液固比的增加，多糖的产率逐渐增加，当达到40∶1（mL/g）时，多糖的产率达到最大，再增加液固比多糖产率下降，因此选用40∶1（mL/g）左右最佳。

图3　液固比对多糖产率的影响Fig.3　The influence ofliquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharide

3.1.4超声时间对多糖产率的影响

提取温度为65℃，液固比为40∶1（mL/g），超声波功率为90 W，研究提取时间对多糖产率的影响，结果见图4。

图4　超声时间对多糖产率的影响Fig.4　The influence of ultrasonic time on extraction yield of polysaccharide

由图4可知，随着提取时间的增加，产率逐渐提高，直到50 min达到最高值。因此选取超声时间为50 min左右为宜。

3.1.5提取次数对多糖产率的影响

提取次数对多糖产率的影响见图5。

图5　提取次数对多糖产率的影响Fig.5　The influence of extraction times on extraction yield of polysaccharide

由图5可知，提取第一次的多糖产率为4.36%，提取第二次的多糖产率为1.28%，提取第三次的多糖产率为0.48%，比较3次提取发现第二次提取占第一次的29%，而第三次提取占第一次的11%，考虑到增加提取次数，会增加生产成本，选取提取2次。

3.2提取工艺条件响应曲面优化试验

以A=（a-90）/30，B=（b-65）/10，C=（c-40）/10，D=（d-50）/10为自变量，以多糖化合物产率为响应值（P），进行响应曲面分析试验。响应曲面试验设计及结果见表2。

表2　Box-Behnken中心组合设计方案及试验结果Table 2　Box-Behnken experimentdesign and the results of these experiments

用Design Expert7.0.0软件对试验数据进行回归拟合分析，得到多糖化合物产率与各因素变量的二次多项回归方程模型：对模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，本试验所选模型不同处理间差异及（P=0.000 2<0.05），R2=0.892 4和Adeq Precisior（信噪比）等于9.024，远大于4，说明回归方程的拟合度和可信度均较高[7]。模型响应值的变异系数CV值为4.36%小于5%，表明试验操作是可信的。从回归模型系数的显著性检验结果可知，模型的一次项D是显著的，二次项A2、B2、C2、D2都是显著的，交互项AB是显著的。说明各因素对多糖化合物产率的影响不是简单的线性关系。

表3　回归模型方差分析及模型系数显著性检验Table 3　Analysis of asriances and significance test of coefficients for the created regression model

3.2.1响应面图分析

响应面图分析见图6～图11。

图6　超声功率与超声温度对多糖产率的影响Fig.6　The influence of Ultrasonic power and ultrasonic temperature on extraction yield of polysaccharide

对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面图如图6～图11所示。由图可见，6个响应曲面均均呈现凸球形曲面，说明两因素间交互作用非常显著。同时，其投影等高线最小椭圆的中心全部落在所选的-1～1范围内，响应值（夏枯草多糖）在4个因子设计的范围内呈现极大值。

图7　超声功率与液固比对多糖产率的影响Fig.7　The influence of ultrasonic power and liquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharide

图8　超声时间和超声功率对多糖产率的影响Fig.8　The influence of ultrasonic time and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide

图9　液固比和超声温度对多糖产率的影响Fig.9　The influence of Liquid-solid ratio and temperature on extraction yield of polysaccharide

图10　超声时间和超声温度对多糖产率的影响Fig.10　The influence of ultrasonic time and temperature onextraction yield ofpolysaccharide

图11　超声时间和液固比对多糖产率的影响Fig.11　The influence of ultrasonic time and solid-liquid ratio on extraction yield ofpolysaccharide

3.2.2最优工艺条件验证

P=1.15+0.024A+0.017B+0.018C+0.033D-0.052AB-0.038AC-7.500×10-3AD-2.500×10-3BC+ 0.020BD-0.057A2-0.089B2-0.15C2-0.07D2

求解方程组得：A=0.070 3；B=-0.009 8；C=0.051 2；D=0.209 6。即超声功率为92.11 W、超声温度为64.90℃、液固比为40.51∶1（mL/g）、超声时间为52.10 min，此时多糖产率理论值可达到4.64%。在试验条件允许的条件下选取超声功率为90 W，超声温度为65℃、液固比为40∶1（mL/g）、超声时间为52 min，验证试验表明，产率为4.60%，与理论值相符较好。因此，采用响应面法得到的提取条件参数相对可靠，具有使用价值。

3.2.3超声辅助提取法与常规溶剂提取法的对比试验

准确称取10.00 g的夏枯草粉末，按40∶1（mL/g）的液固比加400 mL二次蒸馏水于1 000 mL大烧杯中进行溶解后，在80℃的恒温水浴锅中加热8 h，然后抽滤，收集滤液，将滤渣重新用400 mL二次蒸馏水进行溶解后，与第一次同样的温度下再次恒温加热8 h，然后抽滤，收集滤液。将两次收集的滤液合并后用旋转蒸发仪蒸发掉其中的部分水分，将剩余的滤液定容到250 mL的容量瓶中。稀释40倍，进行吸光度的测定。根据2.2中计算多糖产率的公式进行计算，得到多糖的产率为4.16%。试验结果见图12。

由图12可看出，同样的液固比条件下，超声辅助提取夏枯草中的多糖化合物，其产率远远优于常规溶剂提取法。原因是超声波的空化效应使得夏枯草细胞被均匀破坏，多糖化合物较易溶出，而常规溶剂提取法尽管提取时间很长（16 h），但细胞结构没有遭到破坏，多糖化合物传质阻力较大，从而产率较低。

图12　超声提取法与常规溶剂提取法的对比实验结果Fig.12　Comparison of ultrasonic and conventional solvent extraction technology

4　结论

利用由响应面法得到的模型进行探讨，得到夏枯草中多糖化合物的超声辅助提取过程优化的工艺条件：超声功率为90 W、超声温度为65℃、液固比为40∶1（mL/g）、超声时间为52 min、超声提取次数为两次，此时多糖产率可达4.6%。因此，采用响应面法获得的夏枯草中多糖化合物的超声辅助提取工艺条件，数据准确，科学可行。超声辅助提取法与常规溶剂提取法的对比试验结果表明，采用超声辅助提取工艺提取夏枯草中的多糖化合物，产率远远优于常规溶剂提取工艺。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(下册)[M].上海:上海科学技术出版社,1998:56

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Polysaccharide from
Prunella vulgaris L.by Response Surface Methodology

ZHAO Zhi-gang，XUAN Li-ying，LIZhi-ying，GAO Rui-yuan，ZHANG Hai-rong*
（Lab of BiochemicalAnalysis，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharide of Prunella vulgaris L.was studied. Based on the experiment of single factor，the mathematical regression model was established about the dependentvariable（extraction yield ofpolysaccharide）and independent variables（extraction power，extraction temperature，extraction time，ratio of liquid to soild，extraction times）though Box-Benhnken center composite design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction condition were as follow：extracting power of 90 W，extracting temperature was 65℃，the ratio of liquid to solid was 40∶1（mL/g），extracting time of52 min，and extraction times of2.Under these conditions，the practicalyield ofpolysaccharide of Prunella vulgaris L.was 4.60%，which was consistentwith the predicted yield ofpolysaccharide of4.64%.

Prunella vulgaris L.；response surface methodology；polysaccharide；ultrasonic-assisted extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.021

忻州师范学院重点学科建设项目资助计划（xk201402）；山西省高等学校教学改革项目（2015-100）；山西省教育厅重点建设学科项目（20141010）

赵志刚（1964—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：天然植物分离及分析。

张海容（1957—），男（汉），教授，硕士生导师，博士，研究方向：有机分析。

2015-05-19