贵州黑山羊瘤胃一株环状芽孢杆菌的分离鉴定

林聪宏，主性*，粟朝芝，李莉娜，吴仙，韩勇*

(1.贵州大学，贵州 贵阳 550025;2.贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

贵州黑山羊瘤胃一株环状芽孢杆菌的分离鉴定

林聪宏1，主性1*，粟朝芝2，李莉娜2，吴仙2，韩勇2*

(1.贵州大学，贵州 贵阳 550025;2.贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

为了解贵州黑山羊瘤胃液内芽孢杆菌的主要种类，采用亨盖特滚管技术从装有永久性瘤胃瘘管的贵州黑山羊瘤胃中进行菌株的分离培养，其中1株分离菌株经过革兰氏染色、形态观察、16S rDNA序列分析和系统发育树构建，此菌株革兰氏染色阳性，呈杆状，末端钝圆，在系统发育树中与Bacillus circulans strain JSC SF51处在同一分支，鉴定为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans Jordan)。这对开展贵州黑山羊瘤胃微生物区系及瘤胃营养调控等研究具有一定的参考价值。

贵州黑山羊;亨盖特滚管技术;环状芽孢杆菌;分离;鉴定

贵州黑山羊是优良的地方山羊品种，具有适应力强、抗病力强、耐粗饲能力强和肉质优良等特点，作为贵州地方第二大山羊品种，是组成喀斯特地区生态系统的重要部分［1］。贵州黑山羊瘤胃微生物种类多且数量大，主要有细菌、真菌、原虫和少量噬菌体等，各类微生物之间存在着竞争和协同的复杂关系，贵州黑山羊瘤胃细菌数量为109～1010cfu/mL，原虫数量为105～106cfu/mL，真菌游动孢子数为103～105个/mL，噬菌体数量为107～109微粒/mL［2］。瘤胃中降解纤维素的细菌主要包括白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌、芽孢杆菌及梭菌等［3］。环状芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一员，不仅具备促进肠内菌群生态平衡的作用，还有抗逆性强、营养需求低和致病性低等特点，因此也是最理想益生菌类之一［4］。环状芽孢杆菌的发酵产物β－甘露聚糖酶能够提高畜禽的抗病性能，改善动物健康状况，恢复动物的生长性能，进而减小经济损失。将β－甘露聚糖酶添加入日粮中时，可去除饲料中的抗营养因子，促进营养的消化和吸收，并能降低畜禽在病菌感染时的死亡率［5］。研究发现，环状芽孢杆菌中的胞外多糖即使在低浓度情况下都具备相当高的活性［6］，利用这一特性，将胞外多糖的生物活性，如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡等应用于医药领域或成为可能。

本研究利用亨盖特滚管技术［7］从贵州黑山羊瘤胃微生物中分离培养出1株环状芽孢杆菌，为进一步了解贵州黑山羊瘤胃芽孢杆菌种类及微生物区系组成提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃液采集:利用真空泵从已安装永久瘤胃瘘管的贵州黑山羊瘤胃中抽取瘤胃液100 mL，用4层无菌纱布过滤，将滤液移入充有CO2的样品瓶中，立即放入冰盒后迅速带回实验室进行分离。

1.1.2 培养基:参照《绵羊瘤胃主要纤维降解细菌的分离鉴定及不同氮源对其纤维降解能力的影响》中的配方进行培养基准备［8］，并进行微调整。其中:分离培养基配方将维生素混合液从配方中去除，挥发性脂肪酸混合液补充正丁酸1 mL，基础培养液的琼脂用量从15 g调整为20 g，培养液最终pH值调节到7.0;富集培养基进行灭菌前将pH值调节到7.0。

1.1.3PCR试剂:本课题所用dNTP、PMD18－T载体、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、胶回收试剂盒、DL2000 DNA Marker、质粒提取试剂盒和天根细菌DNA提取试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。细菌的16S rDNA通用引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株初筛:将瘤胃液样品以400 r/min离心6 min，将上清液转移到新的离心管中并2 000 r/min离心5 min，取沉淀无菌无氧重悬，梯度稀释到10－6、10－7、10－8，用一次性注射器抽取各稀释度0.5 mL到厌氧试管中做亨盖特滚管培养［2］。滚管时管口朝上，管体倾斜30°，防止培养基凝固堵塞管口。滚管后37℃培养24 h，挑取菌落到富集培养基中培养12 h。取0.5 mL富集培养液到厌氧试管再次滚管，培养后挑菌落进行革兰氏染色，属革兰氏阳性杆菌的菌落则继续分离纯化，直到滚管中菌落形态、颜色和大小一致且革兰氏染色镜检时没有其他杂菌。

1.2.2 菌株富集:将已纯化的单菌接种到富集培养基中进行培养，培养条件与初筛一致，续传3次。

1.2.3 菌株基因组DNA提取:准备经过富集的细菌培养液3 mL，使用细菌基因组提取试剂盒进行菌株DNA的提取，具体步骤参见天根细菌基因组提取试剂盒说明书。

1.2.4 PCR扩增:采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增。所用的引物序列为27F(5’－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3’)和1492R(5’－TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3’)。PCR反应体系采用50 μL体系，包括5.0 μL 10×Ex Taq buffer、4.0 μL 2.5 mM dNTP Mix、10 p Primer 1和10 p Primer 2各1.0 μL、2.0 μL Template、0.5 μL 5 u Ex Taq和36.5 μL ddH2O。PCR反应条件:95℃5 min;95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min 30 s，30 cycles;72℃10 min，4℃终止反应。

1.2.5 16S rDNA序列测定:PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA序列测定。

2 结果

2.1 分离纯化结果与菌落形态经过分离纯化，得到1株革兰氏染色镜检菌体呈末端钝圆的紫色杆菌，菌株编号为2－2－2。在厌氧试管的分离培养基中恒温培养箱中37℃培养24 h，菌落呈乳白色圆形或稍椭圆，扁平光滑。革兰氏染色后镜检，菌体呈末端钝圆的紫色杆菌状。分离菌株在厌氧试管中的菌落形态见图1。

图1 厌氧试管中菌落照片

2.2 细菌基因组DNA提取和PCR产物检测回收得到的DNA片段使用紫外分光光度计检测得出DNA浓度为312.14 ng/μL，OD260/280为1.9，浓度和纯度符合要求。PCR扩增产物中检测到约1.4 kb DNA特异目标带，纯化后完成测序，见图2。

图2 细菌的16S rDNA的PCR产物电泳图

2.3 16S rDNA序列测定分离菌株使用Sanger测序对菌种序列进行测序，将测序结果进行拼接得到的16S rDNA序列见图3。

图3 菌株16S rDNA的拼接序列

2.4系统发育树构建将方法2.3中得到的菌株16S rDNA序列使用NCBI的nucleotide blast进行核酸序列的检索，检索使用blast程序，数据库选择Nucleotide collection(nt)，其他参数使用默认参数。对于检索得到的序列结果，选择Identity较高，E－value较低的序列下载其fasta格式。使用MEGA 6.0软件中的MUSCLE多序列比对程序对上述下载的序列和本次实验测序得到的序列(命名为2－2－2)进行多序列比对(Multiple sequence alignment，MSA)。然后使用多序列比对的结果构建进化树。进化树的结果见图4。

图4 依据16S rRNA序列构建的菌株2－2－2和同属相关种的系统发育树

在Blast的结果中，比对上的序列大部分是Bacillus circulans菌属的细菌。在进化树的结果中，序列之间的亲缘性都很高，遗传距离很近，这与Blast结果相符合。根据序列2－2－2在进化树中的位置，实验得到的序列与Bacillus circulans strain JSC SF51在同一分支上，可以判定本实验测序中所得到的细菌16S rDNA的序列属于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans Jordan)。

3 小结

环状芽孢杆菌对营养要求表现为广谱，在土壤中大量存在，贵州黑山羊采食草料时将其带入瘤胃中，进而在瘤胃内生长繁殖。其适应能力强，能够形成抗逆性很强的芽孢结构，当环境条件适宜时重新萌发形成营养体细胞。本研究采用亨盖特滚管技术从贵州黑山羊瘤胃液中分离得到1株环状芽孢杆菌，经16S rDNA序列测定和系统发育树构建分析，与Bacillus circulans strain JSC SF51在同一分支上，可以判定实验测序中所得到的细菌16S rDNA的序列属于Bacillus circulans Jordan。本研究对了解贵州黑山羊瘤胃微生物区系组成具有重要的意义，对开展贵州黑山羊瘤胃微循环、瘤胃营养调控等研究分析具有一定的参考价值。

［1］陈历俊.盘县“贵州黑山羊”养殖情况调查［J］.农业工程，2014，4(3):167－168.

［2］Hungate R E.A roll tube method for the cultivation of strict anaerobes［C］.UK London:Academic press Inc，1969.

［3］焦万洪，李莉.牛瘤胃内主要细菌结构与功能探查［J］.中国畜禽种业，2016(2):84.

［4］张保全，朱年华.芽孢杆菌在畜牧业中应用的研究进展［J］.江西畜牧兽医杂志，2007(1):2－3.

［5］杨新建，段素云，王伟青，等.环状芽孢杆菌发酵产物在改善肉鸡体重均匀度及健康状况方面的应用研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2014(6):75－77.

［6］Vidhyalakshmi R，Valli N C，Narendra K G，et al.Bacillus circulans xopolysaccharide:Production，characterization and ioactivities［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2016(87):405－414.

［7］Krause D O，Nagaraja T G，Wright A D G，et al.Boardinvited reviewRumen:microbiology:leading the way in microbial ecology［J］.Journal of Animal Science，2013，91(1):331－341.

［8］刘占英.绵羊瘤胃主要纤维降解细菌的分离鉴定及不同氮源对其纤维降解能力的影响［D］.内蒙古农业大学，2008:22－28.

Isolation and Identification of A Bacillus Circulans Jordan in Guizhou Black Goat Rumen

Lin Conghong1，Zhu Xing1*，Su Chaozhi2，Li Lina2，Wu Xian2，Han Yong2*
(1.Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;2.Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang Guizhou 550005，China)

The aim of this study was to isolate and identify a strain of Bacillus circulans Jordan isolated from the ruminal fluid of Guizhou black goat.By using the Hungate Roll Tube Technology，a strain was isolated from the ruminal fluid of Guizhou black goat which fitted with permanent rumen fistula.Based on the results of gram staining，morphologic observation，16S rDNA sequence analysis，and Phylogenetic tree construction，it was confirmed as Bacillus circulans Jordan.This strain was gram positive，the cell was in shape，and the end was blunt，and it was in the same branch with Bacillus circulans strain JSC SF51 in the phylogenetic tree.It was value of the study which Rumen microbiota，rumen nutrient regulation was analyzed in the ruminal fluid of Guizhou black goat.

Guizhou Black Goat;Hungate Roll Tube Technology;Bacillus Circulans Jordan;Isolation;Identification

S827.1

A

1007－1474(2016)03－0007－04

2016－03－29

国家自然科学基金“13C标记LA对贵州黑山羊瘤胃CLA合成影响的生物机制研究”(31460618)

林聪宏(1990—)，男，硕士研究生，主要从事兽医临床方面研究。

*通讯作者:(1)韩勇(1978—)，男，副研究员，博士，主要从事反刍动物营养方面研究。E－mail:hanyong7809@126.com。(2)主性(1972—)，男，副教授，博士，主要从事兽医临床方面研究。E－mail:zhuxin72@126.com