中西药复方制剂治疗鸡传染性鼻炎的研究

张宁，郭莉，韩昱，赵博伟（，河北省畜牧兽医研究所河北保定07000；.保定市冀农动物药业有限公司河北保定07000；.吉林大学吉林长春00；.河北省畜牧兽医局河北石家庄0500）

中西药复方制剂治疗鸡传染性鼻炎的研究

张宁1，郭莉2，韩昱3，赵博伟4
（1，河北省畜牧兽医研究所河北保定071000；2.保定市冀农动物药业有限公司河北保定071000；3.吉林大学吉林长春130012；4.河北省畜牧兽医局河北石家庄050031）

采用超微粉碎技术将筛选出的中药组方制成超微粉与氢溴酸东莨菪碱混合，研制出一种治疗鸡传染性鼻炎的中西药复方制剂，并以磺胺类药物作为对照，进行临床试验。结果证实：该复方制剂治疗效果最佳，生产性能恢复良好；磺胺类药物治疗后复发率达60%，而该复方制剂治疗后复发率为0。

鸡传染性鼻炎；鸡副嗜血杆菌；中药超微粉；氢溴酸东莨菪碱

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.7.044

传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum，Hpg）引起的，临床上以打喷嚏、鼻腔流出黏性分泌物、流泪、结膜发炎、颜面及眼周围肿胀或水肿为主要特征。副鸡嗜血杆菌分为A、B和C三个血清型，每个血清型的灭活菌体之间缺乏免疫保护。目前我国A型菌株的流行占主导地位，部分地区有B型和C型Hpg的存在。

随着我国养鸡业的迅速发展，鸡传染性鼻炎在我国发生、流行呈上升趋势。由于本病潜伏期短，传播迅速，流行期长，产蛋鸡感染后产蛋量下降10%～40%，生长鸡生长停滞，肉鸡因气囊炎导致屠宰加工中废弃增加，造成严重的经济损失，严重阻碍畜牧业的发展。目前治疗鸡传染性鼻炎的常用西药磺胺类，影响产蛋鸡产蛋率、受精率；易造成肾肿、肾出血，降低抵抗力；易产生抗药性，易复发。

鉴于上述鸡传染性鼻炎给养殖业带来的危害及当前治疗方法的研究现状，研制一种药效高、低残留、不易产生耐药性、便于应用的中西药复方制剂是非常必要的。本研究拟通过超微粉碎技术对中药进行粉碎，使药效充分发挥，并与改善微循环的西药氢溴酸东莨菪碱相结合，为临床迅速治疗和控制该病的流行提供方法。

1　中药对副鸡嗜血杆菌抑制作用及耐药性诱导作用的试验研究

1.1试验菌株及药物

副鸡嗜血杆菌A型Hpg-1：购于中国兽医药品监察所。

组方一：益母草、防风、甘草、诃子各100 g，辛荑、桔梗、黄芩、半夏80 g。组方二：金银花100 g、白芷250 g、防风150 g、苍术150 g、黄岑80 g、甘草80 g。组方三：黄芩120 g、麻黄120 g、辛夷花100 g、金荞麦100 g、鱼腥草80 g、桔梗50 g、甘草50 g。组方四：鱼腥草300 g，黄皮叶200 g，紫苏50 g，蒲公英50 g，金银花50 g，板蓝根50 g，大青叶80 g，甘草50 g。组方五：黄芩150 g，玄参100 g，升麻100 g，黄连90 g，牛蒡子90 g，陈皮60 g，甘草60 g，柴胡60 g，桔梗60 g，薄荷30 g，僵蚕90 g。（以上中药材购于安国市祁州中草药材有限公司。）

复方磺胺间甲氧嘧啶钠可溶性粉：购于兽药经营公司。

1.2试验动物

健康商品鸡，试验期间饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。

1.3药物制备

称取洁净干燥药材剪碎后置于烧杯中，加蒸馏水没过药材1 cm左右，浸泡20 min后加10倍于药材量的水，置于电炉加热，煮沸30 min后用纱布过滤，再加5倍于药量的水没过滤渣，煮沸30 min后过滤，将两次滤液合并，用旋转蒸发仪75℃浓缩至1 g/mL，流通蒸汽灭菌20 min，放入4℃冰箱备用。

1.4中药复方的筛选

采用管碟法对中药复方进行筛选。将每个处方的药液分成两份，一份是混合均匀后试验，另一份静置12 h，取上清液进行试验。在平皿中注入10 mL热融的培养基作为底层。另取培养基适量加热融化后，放至45～50℃，加入适量副鸡嗜血杆菌，摇匀，加5 mL于底层上，均匀摊布，作为菌层。冷却后，每个平皿中等距离放置干热灭菌的不锈钢小管（内径6 mm，外径8 mm，高10 mm），加入等量药物，37℃厌氧培养16～18 h，测量抑菌圈的大小。如此进行三次，取平均值。

1.5中药最低抑菌浓度MIC（Minimum inhibitory concentrations）的测定

方法一，采用CLS推荐的琼脂稀释法（Agar Dilution Method）测定药液的最低抑菌浓度。琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃的培养基中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，每毫升培养基中含药液浓度约为500 mg、250 mg、125 mg、62.5 mg、31.25 mg、15.625 mg。药物平板置备好后，接种受试菌0.1 mL，菌液浓度为0.5麦氏浊度，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。

方法二，采用管碟法对药液进行MIC测定。先将药液进行梯度稀释1∶2（500 mg/mL），1∶4（250 mg/mL），1∶8（125 mg/mL），1∶16（62.5 mg/mL），1∶32（31.25 mg/mL），1∶64（15.625 mg/mL）；在平皿中注入10 mL热融的培养基作为底层。另取培养基适量加热融化后，放至45～50℃，加入适量副鸡嗜血杆菌，摇匀，加5 mL于底层上，使均匀摊布，作为菌层。冷却后，每个平皿中等距离放置干热灭菌的不锈钢小管（内径6 mm，外径8 mm，高10 mm），加入等量但不同浓度的药液，孵育后观察抑菌圈的情况，以产生抑菌圈的药液所含最低药物浓度为MIC。

1.6结果与分析

1.6.1中药组方抑菌效果五个组方中除了方一对副鸡嗜血杆菌没有抑菌效果外，其它四个组方均不同程度有抑菌性。其中方三抑菌效果最佳，结果（见表1，图1）。

1.6.2中药最低抑菌浓度MIC结果对中药组方进行最低抑菌浓度MIC的测定，结果显示，组方三和组方四的抑菌效果最佳，二者比较组方三用两种方法测得最低抑菌浓度均能达到31.25 mg/mL，而方四用两种方法测得的MIC分别是62.5 mg/mL和31.25 mg/mL，可见组方三略好于组方四。组方一抑菌效果最差，结果（见表2）。

表1　五个中药组方体外抑菌试验结果

图1　五个中药组方体外抑菌试验图

表2　中药组方对鸡副嗜血杆菌体外最低抑菌浓度MIC的测定（mg/mL）

2　中西复方制剂对副鸡嗜血杆菌的临床疗效试验

2.1攻毒菌液的制备

用生理盐水校正细菌浓度至0.5麦氏浊度，对试验鸡进行眶下窦接种0.2 mL/只，即攻毒剂量约3×107cfu/只。

2.2试验分组

1）中药粗粉试验A组：设三个剂量组（A-1组用药剂量为1 g/只，A-2组用药剂量为3 g/只，A-3组用药剂量为5g/只），于日粮中混饲，连续饲喂至控制病情稳定。

2）中药微粉试验B组：设三个剂量组（B-1组用药剂量为1 g/只，B-2组用药剂量为3 g/只，B-3组用药剂量为5 g/只），于日粮中混饲，连续饲喂至控制病情稳定。

3）中西药复方试验C组：即中药微粉与西药氢溴酸东莨菪碱联合应用，设三个剂量组（中药微粉的剂量分别为：C-1组用药剂量为1 g/只，C-2组用药剂量为3 g/只，C-3组用药剂量为5 g/只；氢溴酸东莨菪碱的用量均为0.015 mg/只），微粉于日粮中混饲，氢溴酸东莨菪碱集中混饮，连续使用至控制病情稳定。

4）化药对照D组：化药为复方磺胺间甲氧嘧啶钠可溶性粉，按照兽药国家标准使用，混饮，每1 L水，1～2 g，连用3～5 d。

200只170日龄健康商品蛋鸡，无传染性鼻炎感染史，产蛋率在80%，随机分组，每组各20只。

2.3药物治疗试验

试验用鸡，除健康对照组外，其余各组攻毒，攻毒后观察发病情况，出现临床症状后开始治疗。

治疗结束后继续饲养2个月，正常喂料饮水，观察各组鸡只的复发情况。

2.4疗效评价

精神状态，食欲，临床症状，死亡率，产蛋率，复发情况及病理剖检。

2.5结果与分析

攻毒24 h后，各组鸡只均表现精神沉郁，采食量轻微减少，个别鸡只出现眼结膜炎，打喷嚏的症状；48 h后，各组鸡只采食量明显下降，产蛋率轻微下降，半数以上鸡只出现面部、眼睑不同程度水肿，甩鼻或挠鼻现象；72 h后，各组鸡只的发病率均达到90%～100%，开始用药治疗。

A组3个剂量水平中、高剂量治疗时间均为10 d，即大部分症状消除，采食量恢复，精神状态良好；低剂量组治疗12 d后临床症状消除，但停药1周后，又有个别鸡只复发，复发率在20%，又进行连续用药6 d痊愈，精神状态、采食量及其它临床症状消失，直至实验结束未再复发。

B组和C组的低剂量治疗时间一致，均耗时8 d；B组的中、高剂量组和C组的高剂量组治疗时间为7 d；C组的中剂量组用药5 d后痊愈；且B组和C组均未见病情复发。

D组为磺胺药物对照组，按照国家标准剂量用药，4 d后基本痊愈，无死淘；但停药2周后，病情反复，高达60%的复发率，连续用药5 d痊愈；停药10 d后，又复发，复发率30%，于是选择C-2治疗方案，4 d痊愈，试验结束前未再复发。

磺胺组治疗效果最迅速，但极易复发，经过3次治疗才将病情控制，综合耗时最长；中药组方中，相同剂量比较，微粉的治疗时间整体上比粗粉组短，中西药结合的微粉中剂量组治疗周期最短；从产蛋率的恢复情况看，微粉组的效果要好于粗粉组；中西药结合微粉组产蛋恢复整体上好于中药微粉组；从复发情况来看，磺胺药组复发两次，复发率分别为60%和30%，粗粉组低剂量复发一次，复发率为20%，其它中药组无论是中高剂量粗粉组，还是微粉组，亦或中西药结合微粉组共8组，未见复发情况出现。综合各项数据，中西药结合微粉组中剂量，治疗周期短，效果明显，产蛋率恢复值高，且不复发（见表3）。

表3　药物临床试验数据比较

3　抗菌中药组方及与氢溴酸东莨菪碱复方的急性毒性试验

中药毒理学试验研究是预测中药制剂安全性的一个重要手段。通过毒理试验了解中药制剂的毒性反应、毒性强度、毒害发展过程及毒性作用是否具有可逆性。安全性试验是开发研制新药不可缺少的环节，为了检验中药制剂和联合用药的安全性，做急性毒性试验和耐受性试验是必要的。

3.1试验动物

健康昆明小鼠100只，20±2 g，雌雄各半，分笼饲养，饲养温度为25～35℃，湿度为60%，饲以固体饲料，自由饮水。

3.2试验用药及给药剂量

中药基础给药剂量为2 mL/kg（临床用量2g/kg的2倍），西药基础给药剂量为0.13 mg/kg（临床用量的13倍），按照1∶1.4的等比级数设2 mL/kg+ 0.13 mg/kg、2.8 mL/kg+0.18 mg/kg、3.92 mL/kg+0.25 mg/kg、5.49mL/kg+0.36 mg/kg、7.68 mL/kg+0.50 mg/ kg、10.76 mL/kg+0.70 mg/kg、15.06 mL/kg+0.98 mg/kg 7个给药剂量组，另外在设1个高剂量组即20 mL/kg+1.0 mg/kg（中药剂量为临床拟推荐剂量的40倍，西药用量为临床拟推荐剂量的100倍）以及一个空白对照组共计9个试验组。

3.3试验方法

将90只健康小鼠，随机分为9个组，每组5只雄性小鼠和5只雌性小鼠。其中8个给药组，1个作为空白对照组。

禁食8 h（不禁水）后，各给药组均按每只小鼠的体重计算出给药量，每只小鼠均用金属胃管经口灌服给药一次。空白对照组的小鼠自由采食和饮水。

3.4临床观察及观察指标

各组小鼠给药后连续观察1周，随时观察小鼠精神、食欲、饮水、活动及有无中毒情况并及时记录小鼠的临床表现及动物死亡数。

3.5结果

给药组小鼠全部存活且小鼠的采食、饮水、精神状态、活动情况及大小便等均未出现明显异常，与空白对照小鼠的采食、饮水、精神状态、活动情况及大小便等相同，说明该中西药复方对小鼠的临床表现无影响。本次试验没有小鼠死亡情况出现。

4　最大耐受剂量试验

根据《新药中药药理毒理研究的技术要求补充说明》，并参照《兽药试验技术规范汇编》及《新药临床前安全评价与实验》，中药制剂因药物浓度或给药体积过大，无法测出LD50时，可给予动物能够接受的最大浓度下的最大体积进行急性毒性测定，并可在24 h内口服多次（2～4次），以观察7 d内产生的不良反应。

4.1中药组方最大耐受剂量试验

4.1.1材料健康昆明小鼠，体重18～22 g，雌雄各半。分笼饲养，饲养温度为25～35℃，湿度为60%，饲以固体饲料，自由饮水。

中药组方水煎提取2次，30 min/次，8层纱布过滤，合并滤液，浓缩至2∶1（即1 mL煎液相当于原生药2 g）备用。

4.1.2试验方法取健康小鼠20只，雌雄各半，禁食8 h，给药总剂量为2 mL/只/20 g，8 h内分2次用金属胃管经口灌服给药，每次1 mL/只/20 g。给药后，小鼠自由进食、饮水，给药后24 h内严密观察受试动物情况，以后观察次数可逐渐减少。另设不用药对照组。

连续观察7 d，随时观察小鼠精神、食欲、饮水、活动及有无中毒情况并及时记录小鼠的临床表现及动物死亡数。对死亡小鼠及时剖检，观察各脏器的变化。第8天断头处死全部存活小鼠，剖检，逐一观察记录脏器的变化。

4.2中药组方与西药氢溴酸东莨菪碱联用最大耐受剂量试验

4.2.1材料及剂量健康昆明小鼠，体重18～22 g，雌雄各半。分笼饲养，饲养温度为25～35℃，湿度为60%，饲以固体饲料，自由饮水。

将精密称量的氢溴酸东莨菪碱溶解于中药液中，灌胃剂量2 mL/只+0.04 mg/只，其中：中药组方用量2 mL/只（每只小鼠体重约20 g，即约100 mL/kg的2倍浓缩液，相当于临床用量2 g/kg的100倍），西药用量0.04 mg/只，即2 mg/kg相当于临床用量的200倍。

4.2.2试验方法同3.3。

4.2.3结果与分析小鼠给药后，有一半数量的小鼠表现活动显著减少，采食和饮水显著减少；24 h后小鼠的行为、活动、呼吸、饮水、采食、精神状态、大小便及对外刺激反应均正常，且无一动物死亡。连续观察7 d，第8天捕杀全部存活小鼠，进行肉眼病理学观察，通过观察脏器颜色、形状、大小等，中药组方最大耐受量组及中西药复方最大耐受量组均未见异常变化。

试验结果显示，该中药组方在2倍浓缩下，最大允许容量2 mL/20 g/d，小鼠的最大耐受剂量大于100 mL/kg（以非浓缩液计算，即以中药散剂计算为200 g/kg）；该中药散剂的靶动物鸡1 d的临床用药推荐剂量约为2 g/kg。可见小鼠灌服该中药的最大耐受剂量为靶动物用药剂量的100倍左右；配合西药氢溴酸东莨菪碱（用量即2 mg/kg相当于临床用量0.01 mg/kg的200倍）的条件下仍无任何不良反应。表明该制剂用药安全。

5　讨论

化药治疗鸡传染性鼻炎，见效快但极易复发。本研究从现代中兽医理论出发，选定的组方中各味药材中均含有治疗鸡传染性鼻炎的有效成分。麻黄的主要成分为麻黄碱、伪麻黄碱等生物碱，能松弛支气管平滑肌、缓解支气管平滑肌痉挛的作用等。辛夷花有镇痛、镇静及收缩鼻黏膜血管的作用。黄芩有效成分为黄芩苷、黄芩素等，体外抗菌试验对伤寒杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、溶血性链球菌等有抑制作用。鱼腥草（有效成分癸酰乙醛）对多种革兰阳性细菌和阴性细菌（如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、卡他球菌、白喉杆菌、变形杆菌、志贺、施氏、福氏及宋内痢疾杆菌、肠炎杆菌等）均有不同程度的抑制作用。金荞麦含野荞麦苷，水解后生成对香豆酸、阿魏酸及葡萄糖；另含有双聚原矢车菊甙元；金荞麦对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均有抑制作用。桔梗含有桔梗皂甙，具有祛痰镇咳的作用。甘草含有甘草次酸、甘草甜素等，甘草次酸有明显的中枢性镇咳作用；此外甘草甜素、甘草次酸盐尚有抗炎症及抗过敏、抗菌、等作用；甘草甜素对某些药物中毒、食物中毒、体内代谢产物中毒都有一定的解毒能力。

临床试验和急性毒性试验结果表明，磺胺类药物治疗迅速，但极易复发，而中药微粉组方加氢溴酸东莨菪碱组安全无毒，治疗效果明显，用药周期短，生产性能恢复得比较好，且不复发。■（编辑：赵晓松）

Study on the Treatment of Avian Infectious Coryza with Compound Preparation of Chinese and Western medicine

Zhang Ning1，Guo Li2，Han Yu3，Zhao Bowei4
（1.Hebei Research Iustitute of Animal Science and Veterinary Medicine，Baoding HeBei 071000，；2.BaodingJinong agricultural animal pharmaceutical Co.，Ltd.Baoding HeBei 071000；3.Jilin University，Changchun JiLin 130012；4. Hebei Animal Husbandry and Veterinary Bureau，ShiJiazhuang HeBei 050031）

Grind traditional Chinese prescriptions medicine screened and scopolamine hydrobromide into ultra fine powder using ultrafine grinding technology，a compound preparation of Chinese and Western medicine for curing avian infectious coryza is developed.Sulfa drugs used as controls for clinical trials.The results confirmed:This compound preparation has best treatment，the avian performance recovered well. After sulfa drugs，avian infectious coryza recurrence rate was 60%，while the compound preparation after treatment relapse rate was zero.

avian infectious coryza，Haemophilus gallinarum，herbal superfine powder，Scopolamine hydrobromide

项目来源：河北省畜牧兽医局资助项目：2011-1-03。

张宁（1976-），女，汉族，河北省博野县人，高级兽医师，硕士，从事兽医传染病预防研究工作。