“题说”2015年高考题中的微生物计数法

韩翠翠

(江苏省南京市江宁高级中学 211100)

高中阶段学生所学的微生物的计数方法有显微镜直接计数法和稀释涂布平板法，高考题中经常出现对这两种方法的考核，如2015年高考江苏卷第3题、新课标I卷第39题和四川卷第3题。然而在解题中，学生常常会对这两种方法的实验原理和计数搞混淆。现将这两种方法进行比较，并辅以例题进行解析，以便学生理解应用。

1 实验原理

1.1 显微镜直接计数法 显微镜直接计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板(也叫做血细胞计数板)，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格。但是，不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。

例1 (2015江苏高考卷·13) 血细胞计数板是对细胞进行计数的重要工具，下列叙述正确的是

A．每块血细胞计数板的正中央有1 个计数室

B．计数室的容积为1mm×1mm×0. 1mm

C．盖盖玻片之前,应用吸管直接向计数室滴加样液

D．计数时,不应统计压在小方格角上的细胞

解析：每块血细胞计数板的正中央有2个计数室，A错误；每个计数室的容积有1mm×1mm×0.1mm，B正确；向血细胞计数板中滴加样液前应先盖上盖玻片，让样液自行渗入计数室，若先滴加样液，统计结果会偏大，C错误；计数时，需统计小方格内以及小方格相邻两边及其顶角的细胞，D错误。答案：B。

1.2 稀释涂布平板法 稀释涂布平板法是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使之成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板上，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。该法一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

2 计数方法

2.1 血细胞计数板的计数方法 显微镜直接计数法要用到血球计数板，使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。计数时，如使用规格为16×25型的血球计数板，则在计数室内选4个中方格(左上、右上、左下、右下4个角)中的菌体进行计数，若使用规格为25×16型的血球计数板，则在计数室内选5个中方格(4个角和中央)中的菌体进行计数。对于位于格线上的菌体，一般只统计两条格线上的菌体，按照“数上不数下，数左不数右”的原则计数。分别记录所选中方格中的菌体数，再算出每个小方格内菌体数的平均值，乘以400，就能得出一个大方格中菌体的总数，然后换算出1mL悬液中菌体总数。(已知：1mL=10mm×10mm×10mm= 1000mm3； 0.1mm3=10-4mL；1mL悬液中待测菌体总数=1个小方格中菌体平均数×400×104×稀释倍数)。

例2 在“探究培养液中酵母菌种群数量变化”的实验中，将酵母菌培养液稀释103倍后，用血细胞计数板(规格为1mm×1mm×0.1mm)进行计数，观察图1的视野。有关叙述错误的是

图1 显微镜下视野

A．血细胞计数板计数时，应先在计数室上方加盖玻片，再滴加少量样液

B．计数同一样品时，可对同一计数板上的两个计数室进行计数，并取平均值

C．滴加培养液后应立即计数，以防止酵母菌沉降到计数室底部

D．若仅依据图示结果，可以估算培养液中酵母菌密度为3.5×109个/mL

解析：血球计数板使用时应该先盖盖玻片，再滴加样液，所以A正确。一块血球计数板上有两个计数室，可以对同一计数板上的两个计数室进行计数，并取平均值，所以B正确。滴加培养液后，要等酵母菌沉降到计数室底部再计数，不应立即计数，所以C错误。若仅依据图示结果，可以看出一个中方格有14个酵母菌，其含有16个小方格，则一个小方格含酵母菌平均数为0.875个，则该培养液酵母菌密度为0.875×400×104×103=3.5×109个/mL。答案：C。

2.2 稀释涂布平板法的计数方法 该法统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在 30～300的平板进行计数(每克土壤样品的细菌数=某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数/涂布所用的稀释液的体积×稀释倍数)。

例3 某同学计划统计食醋中该发酵菌的总数，他选用10-4、10-5、10-6稀释液进行涂布，每种稀释液都设置了3个培养皿。从设计实验的角度看，还应设置一组对照实验是________。该同学在稀释倍数为10-4的培养基中测得平板上菌落数的平均值40.4，则每毫升样品中的菌体数________个(涂布平板时所用稀释液的体积0.2mL)。

解析：生物学设计实验的原则是对照原则，因此还应设置一组不接种的空白培养基作为对照组，以检测培养基灭菌是否彻底。每克样品中菌体个数=(40.4/0.2)×104=2.02×106。答案：一组不接种的空白培养基 2.02×106。

3 计数结果与待测样品中实际含菌数量比较

显微镜直接计数法的缺点是不能区分死菌和活菌，因此计数结果与待测样品中实际含菌数量相比往往偏高。

为了避免把死菌计数在内，可以对待测菌体染色，如“观察酵母菌的种群数量的动态变化”实验，用台盼蓝染色，被染成蓝色的，为死菌。反之，为活菌。

稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是样品一般不易完全分散成单个个体，而且当两个或多个活细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

例4 (2015年新课标I·39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：

(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用于________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。

(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。

(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用________法进行计数。

(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，________℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________℃设计后续实验。

解析：(1)油脂可被苏丹III染液或者苏丹IV染液染成橘黄色或红色。由于不易挥发，故采用萃取法。(2)脂肪酶的微生物B可以分解脂肪，故可以以脂肪为碳源的固体培养基进行培养，不产生脂肪酶的微生物无法生存。(3)微生物B的菌体数，可在显微镜下用血细胞计数板直接计数，活菌用稀释涂布平板法。(4)45℃降解10g油脂所需酶量最大，故酶活性最小；40℃温度下降解10g油脂所需酶量最小，故酶活性最大，围绕40℃温度进行后续实验设计。答案：(1)苏丹III(或者苏丹IV) 萃取法 (2)油脂 (3)血细胞计数板 稀释涂布平板 (4)45 40。