血浆microRNAs：HCV阳性肝硬化新的生物标记物

张庆　刘彦斌　曹平虎　曾鑫　刘杰

血浆microRNAs：HCV阳性肝硬化新的生物标记物

张庆刘彦斌曹平虎曾鑫刘杰

目的 探讨血清microRNA（miRNA）在丙型肝炎病毒阳性的肝硬化中的表达情况。方法 采用实时定量PCR（Real-time PCR）的方法检测miR-30c-5p和miR-302c-3p在丙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒阳性的肝硬化患者血清中的表达。结果 miR-30c-5p和miR-302c-3p在丙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒阳性的肝硬化患者中表达均增高。结论 丙型肝炎病毒阳性的肝硬化患者血清中的miR-30c-5p和miR-302c-3p表达增高，可能作为监测和诊断丙型肝炎病毒阳性的肝硬化的生物标志物。

丙型肝炎病毒；肝硬化；miR-30c-5p；miR-302c-3p

全球约3%的人口已经感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）。HCV感染一般会诱导慢性肝病，包括慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌，严重影响人类的身心健康［1］。肝癌是常见的恶性肿瘤之一，同时也是导致全球癌症相关死亡的原因之一［2］。肝癌早期很难被发现及诊断，所以肝癌一旦被诊断，其患者的生存期往往只有几个月。几乎90%的肝癌是由肝硬化发展而来的。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎等在肝癌的发生发展中起至关重要的作用［3］。HCV是引起急性和慢性肝炎的主要原因。目前临床上诊断肝硬化主要以临床及影像学特征为依据，尚无确切的分子生物学标记。

作者单位：汉中市中心医院感染科，陕西 汉中 713000

通讯作者：张庆，E-mail：drzhangqing@163.com

MicroRNAs（miRNA）是一类由20～25个碱基组成的非编码的小RNA分子，其在器官发育、分化、细胞增值和凋亡中起重要的作用。越来越多的研究表明，miRNA稳定存在于血清、血浆、尿液、唾液等体液中［4］。循环中的miRNA已成为疾病的无创的监测指标，如肝脏损伤、肾脏损伤、肿瘤等［5］。Zehra Oksuz等［6］首先报道了miR-30c-5p和 miR-302c-3p在HCV阳性肝硬化中表达降低，可能成为监测和诊断肝硬化的生物标记物。那么，这些miRNA是否在国人中实现生物标志物的作用？

1　材料和方法

1.1研究对象

选取2014年10月～2015年10月我院感染科住院患者，根据是否肝硬化分为丙型肝炎组和HCV阳性肝硬化组，其中丙型肝炎患者30例，男19例，女11例，年龄21～67岁，平均年龄（43±8.9）岁；HCV阳性肝硬化患者35例，男20例，女15例，年龄27～65岁，平均年龄（45±10.5）岁。所有患者均接受Real Time-PCR检测为HCV RNA阳性。对照组为正常健康人的血液，共10例，男6例，女4例，年龄31～58岁，平均年龄（44±8.4）岁，并检测HCV RNA阴性。实验组和对照组一般资料比较差异无统计学意义。实验组和对照组对象均签署了知情同意书。

1.2仪器与试剂

ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System（Life公司）。TRIzol购于Invetrigen公司；逆转录试剂盒和SYBR Prime miRNA RTPCR检测试剂盒购自上海生工生物公司；miRNA特异性检测引物购自上海生工生物公司。

1.3血浆中总RNA提取

血浆中总RNA从200 μl血浆中提取，采用TRIzol方法。（1）200 μl血浆中加入800 μl TRIzol，混匀，加入200 μl三氯甲烷，剧烈震荡15 sec；（2）4℃12 000 g离心15 min，上清移入去RNA酶EP管，加入500 μl提前预冷的异丙醇，混匀，室温静置15 min；（3）4 ℃12 000 g离心20 min，可见管底白色沉淀，弃上清，加入1 ml 75%的乙醇（DEPC水配制）清洗；（4）4 ℃ 12 000 g离心10 min，弃上清，将RNA干燥5～10 min，加入20 μl DEPC水溶解备用。

cDNA合成及Real Time-PCR。

cDNA合成及Real Time-PCR按照SYBR Prime miRNA RTPCR试剂盒的标准操作进行操作。电脑记录熔解曲线，采用相对定量法分析目的基因相对表达量，以 N= 2-∆∆Ct表示∆∆Ct =（CtmiR目的基因-CtU6）-（CtmiR标准-CtU6）。每个实验重复3次。

1.4统计学分析

患者的临床资料采用2-sidedχ2检验，比较miRNA在丙型肝炎组、肝炎组和对照之间的差异采用Mann-Whitney U检验。所有统计学数据采用SPSS 19.0软件，图表用GraphPad Prism 5.0。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

慢性丙肝组患者血清miR-30c-5p和 miR-302c-3p表达高于正常对照组，两组比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）；HCV阳性肝硬化组患者血清miR-30c-5p和miR-302c-3p表达高于正常对照组，两组比较差异均具有统计学意义（P＜0.001），见图1。

图1　miR-30c-5p和 miR-302c-3p在慢性丙型肝炎和HCV阳性肝硬化患者血浆中表达升高

3　讨论

丙型肝炎病毒感染患者约有80%的患者发展为慢性感染，并且约有20%的患者会在20～30年内发展为肝硬化或肝癌［7］。肝硬化的诊断及早期干预是预防肝癌的一种有效方法。因此，对肝硬化的诊断具有重要的临床意义。血清学检测是近年来发展较快并对肝硬化有一定诊断价值的非创性诊断方法。近年来研究报道，miRNA稳定存在于血清、血浆、尿液、唾液等体液中［4］。研究表明，miRNA成为诊断癌症和其他疾病的新颖生物标记物。本研究结果表明：miR-30c-5p和 miR-302c-3p在慢性丙型肝炎及HCV阳性肝硬化患者中表达升高。这与Zehra Oksuz等［6］的研究结果基本一致。

目前，肝硬化中大多数监测标记物为蛋白，如透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、 Ⅲ型胶原 N端肽等［8-9］。而蛋白标记物有它的缺陷，首先就是特异性和重复性较差；第二，蛋白标记物的监测，使得临床工作检测复杂，没有商品化试剂盒，且蛋白的灵敏度低，不易发现变化。理想的生物学标记应该无创、简便、快速、准确。

B超可以通过观察肝脏形态的大小、肝脏实质光点形态和分布，对肝硬化做出判断，具有无创、直观、操作简单等优点。也有研究报道B超对肝硬化诊断具有较高的临床价值［10］。但是，B超只是一个宏观的观察表现，并没有对肝硬化组织进行定量分析。

CT可以对肝脏体积及血流灌注进行观察，可以显示肝脏大小和体积指数增大，动态反应肝脏纤维化向肝硬化转变的过程及肝脏损害程度的逐渐加剧。核磁共振成像（MR）是将生物力学与影像学结合，是测定肝硬化严重程度的影像学方法。CT和MR对肝硬化的诊断，尤其是肝纤维化阶段的诊断尚处在研究阶段，对纤维化的判断各项指标有重叠，距离应用于临床还有一段距离［11］。

综上所述，miR-30c-5p和 miR-302c-3p在丙型肝炎病毒阳性的肝硬化患者中表达升高，可以作为监测丙型肝炎病毒阳性肝硬化的生物学标志，并具有无创、简便、快速、准确的特点。

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New Biomarkers for microRNAs: HCV Positive Liver Cirrhosis in Patients With Plasma

ZHANG Qing LIU Yanbin CAO Pinghu ZENG Xin LIU Jie Department of Infectious Diseases， Hanzhong Central Hospital， Hanzhong Shanxi 713000， China

Objective To discussion serum miRNAs expression levels in patients with HCV-positive cirrhosis. Methods Using real-time quantitative PCR （PCR Real-time） method to detect the expression of miR-30c-5p and miR-302c-3p in the serum of hepatitis C virus and hepatitis C virus positive patients with cirrhosis. Results The expressions of miR-30c-5p and miR-302c-3p is up-regulated in patients with HCV-positive cirrhosis and HCV infection. Conclusion The upregulated expressions of miR-30c-5p， miR-302c-3p may serve as a biomarker for monitoring and diagnosis of HCV-positive cirrhosis.

HCV， Cirrhosis， miR-30c-5p， miR-302c-3p

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.19.026

R735

A

1674-9308（2016）19-0043-03