小黄姜组培快繁技术研究

黄　明，赵懿琛，赵德刚*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院,山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025)



小黄姜组培快繁技术研究

黄明1，赵懿琛2*，赵德刚1*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院,山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

以贵州省六盘水市特产小黄姜茎尖为外植体，进行了组织培养快速繁殖技术研究。结果表明：消毒时间对茎尖成活率影响很大，以0.1%HgCl2消毒15 min最有效。筛选出了不定芽分化的最适培养基 (MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L)，实现了小黄姜的继代和增殖同步化，组培苗移栽到营养土与珍珠岩为3∶1的混合基质中生长，成活率达到94%。

六盘水小黄姜; 茎尖; 组培快繁

姜 (ZingiberOfficinale.，染色体为2n=2x=22) 属多年生单子叶草本植物，生产上为单季栽培[1]；它在植物分类学上属于姜科、姜属，又称黄姜、生姜等，是具有很高经济价值的药食两用植物，我国重要的经济作物之一[2]。新鲜的姜中含有碳水化合物、蛋白质、姜辣素、姜油酮、姜烯酚、姜醇和无机盐等，并含有人体需要的多种矿物质和维生素[3]，在我国，生姜是普遍食用的香辛调味品，素有“菜中之祖的美称”，其在医药上有增加体温、除湿祛寒等多种功能[4]。生姜以地下根状茎繁殖为主，由于长期的无性繁殖，导致姜体内积累了多种病毒病菌，浸染生姜的主要病菌主要是植物青枯菌[5]，病毒是烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)[6-7]，在生姜生产过程中，容易出现姜腐烂病、枯萎病等病害，导致其体内过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性下降，从而致使生姜品质变劣、产量下降[8-9]。近年来，应用组织培养手段进行繁殖，成为了研究的热点。本文以贵州省六盘水市当地主要栽培种小黄姜为材料，对小黄姜茎尖分生组织进行脱毒、诱导和增殖研究，希望为贵州生姜种苗产业化提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料

贵州省六盘水市主栽种小黄姜(ZingiberOfficinale)为材料。

1.2方法

1.2.1外植体的获得

选取块大、肉厚、颜色黄亮的健壮姜块为材料，将其洗净置于珍珠岩中，在光照培养箱中培养，并保持珍珠岩湿润。至姜芽萌发到1～2 cm时，将姜芽切下作为接种材料的外植体[10-11]。将切取的姜芽用自来水冲洗干净，然后用75%酒精消毒1 min，用无菌水冲洗3～4遍，接着用0.1%升汞溶液消毒，消毒时间设4个梯度 (5 min，10 min，15 min，20 min)。最后再用无菌水冲洗4～5遍。用灭菌后的吸水纸吸干表面水分后，切取5 mm大小的芽尖接种到芽诱导培养基上。

1.2.2培养基及条件

以MS为基本培养基[12]，添加不同浓度的激素作为诱导和继代培养基。4种芽诱导培养基配方分别为：1号：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L, 2号：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，3号：MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L, 4号：MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。增殖与生根同步培养，培养基配方为：MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L。以上培养基均添加3.0%蔗糖、0.7%琼脂，pH值为5.8，培养温度26～28℃，每次接种暗培养3 d后转为光照培养，每天连续光照14 h[13]。

1.2.3炼苗与移栽

姜的组培苗在增殖与生根同步培养基上生长45天左右后，根长大约4～6cm，打开培养瓶盖并加入少量的水，在室温下炼苗8 d，然后小心取出组培苗，冲洗干净根上附着的培养基。幼苗经炼苗后移栽到营养土、珍珠岩、营养土+珍珠岩为3∶1的三种基质中，30天后统计成活率。

2　结果与分析

2.1不同消毒时间对外植体的影响

在植物无菌组织培养实践中，对外植体消毒时间不够，就会有细菌或真菌污染，消毒时间过长，又会造成消毒剂对外植体的毒害造成死亡。本研究对小黄姜外植体以0.1% HgCl2作 5、10、15和20 min的 4个不同时间处理，在培养40天时，结果是以消毒15min的处理的成活率最高。达到65.7%，外植体污染率明显比处理5 min和10 min的少，为17.1%；消毒10 min的成活率为25.8%，污染率却高达58.1%；消毒20 min处理的污染率虽然很低，才4.0%，但成活率也最低，仅8.0%。5 min的消毒处理时间过短，也因污染率很高(90.9%)造成死亡率增加，成活率仅为9.1%(见表1)。因此，小黄姜芽作为外植体以0.1%HgCl2消毒至少需15 min以上为宜，超过20 min又会因HgCl2毒害影响成活率。

表1　0.1% HgCl2消毒处理对小黄姜茎尖外植体污染率、成活率的影响

2.2不同激素配比对小黄姜不定芽分化的影响

无菌条件下培养小黄姜茎尖4周以后，茎尖基部逐渐膨大，达到原来体积的7～8倍后，外植体脱分化细胞分裂形成愈伤组织，然后再分化出绿色不定芽。在不同激素配比的培养基上，不定芽分化数量差别很大，在设置的4种激素配比培养基上，在培养30天时，分化率分别为66%、47%、57%和73%，其中以4号培养基不定芽分化的效果最好(见表2)。

表2　不同激素浓度对小黄姜不定芽分化的影响

2.3试管苗快繁技术

从外植体不定芽的茎基部0.5～1 cm处切下不定芽，转接到新鲜培养基(MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L)上进行继代培养和增殖培养，诱导生根，35 d后进行二代继代苗的增殖，45 d时，试管苗生长茂盛，植株高度接触到瓶盖时，进行炼苗移栽，实现增殖和生根的同步化，提高了快繁的效率(图3)。

图1　小黄姜的组培快繁过程Fig.1　The process of tissue culture and rapid propagation of small yellow ginger

注: A: 茎尖培养; B: 茎尖生芽, 幼芽在分化培养基培养14 d; C: 幼芽增殖, 增殖培养基20 d; D: 幼芽增殖, 增殖培养基培养25 d; E: 生根壮苗, 在增殖与生根培养基上生长32 d; F: 生根壮苗, 在增殖与生根培养基上生长38 d; G: 生根壮苗, 在增殖与生根培养基上生长45 d; H: 组培苗移栽花盆中生长。

2.4炼苗与移栽

在生根培养基上培养45 d后，打开瓶盖，在室温下炼苗8 d后移栽到不同基质中，移栽后30 d统计成活率，以营养土与珍珠岩按3∶1混合的基质种植组培苗最佳，成活率达到94%；其次是珍珠岩，成活率为87%；仅营养土基质移栽的苗成活率最差，为73%。

3　小结与讨论

近三十年来，国内外对生姜脱毒脱菌快繁技术研究已经取得长足的进步。在澳大利亚等国已进入了商品化生产阶段。目前，国内外有关生姜快繁技术的报道不断增多。黄菊辉等[14]人认为NAA和6-BA能够促进生姜幼芽的发生，且具有相互增益的效果。唐玉明等[15]报道，相比于加入KT的培养基，加入6-BA的培养基能够更有效的诱导愈伤组织。葛胜娟[16]的研究也进一步证实，在添加不同激素的培养基中，NAA和6-BA的组合能够更好的促进生姜幼芽的分化和增殖。说明培养基中激素种类和浓度对生姜快繁有显著的影响。研究发现，在NAA浓度相同的情况下，当添加的6-BA浓度由1.5 mg/L逐渐增加到3.5 mg/L时，不定芽的分化率显著提高，但当6-BA的浓度继续增加时，可能会导致组培苗畸形，弱苗数增多[13]，因此6-BA的浓度在3.5 mg/L时比较适宜，生姜在组培的过程中很容易长根。吴家丽[17]和雷开荣[18]都认为在生姜组培快繁时增殖和生根可以同步进行，增殖和生根的同步化，可以缩短培养时间，减少实验成本。此外，在生姜组培快繁中，做好消毒灭菌工作尤其重要。 本研究在前人研究的基础上，通过对贵州省六盘水市小黄姜组培技术的研究，发现适宜的外植体消毒时间为0.1% HgCl2处理15 min，不定芽分化培养基为MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，继代与增殖培养基为MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖与生根同步培养。小黄姜炼苗移栽以营养土和珍珠岩按3∶1混合最好。利用本研究的组培技术，可以实现小黄姜脱毒脱菌种苗的快速繁殖。

作者贡献：黄明是本研究的执行人，完成试验研究、数据统计分析，论文初稿写作；赵懿琛是项目主持人，负责项目设计及论文修改。赵德刚负责参与论文构思与修改。全体作者都阅读并同意最终文本的发表。

致谢：感谢贵州省科技厅-贵州大学联合基金(黔科合LH字[2014]7678)对本项目的资助。

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Rapid Propagation of Small Yellow Ginger

HUANGMing1,ZHAOYi-chen2*,ZHAODe-gang1*

(1.TheKeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation),InstituteofAgro-BioengineeringandCollegeofLifeSciences,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.SchoolofPharmaceuticalSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,Ghina)

In order to investigate microprogation of ginger, we used Liupanshui small yellow ginger(ZingiberOfficinale) shoot tip as the explant for this study. According to the results, the proper sterilization time was important for the survival rate of the shoot tip, disinfection in 0.1% HgCl2for 15 min give the best survival rate. The best medium of adventitious buds propagation was MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L. We achieved the subculture micropropagation. The shoot plantlets were transplanted into nutrient soil : perlite with 3∶1 mixing matrix, the survival rate of the plantlet reached 94%.

Liupanshui small yellow ginger; shoot tip; tissue culture

1008-0457(2016)03-0063-03国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.012

；修回日期：资助项目：贵州省科技厅-贵州大学联合基金(黔科合LH字[2014]7678)。

赵懿琛(1987-)，女，副教授，主要研究方向：植物分子生物学、植物信号转导及免疫，E-mail: z.yichen@yahoo.com;赵德刚(1961-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向：植物生理与分子生物学，E-mail: dgzhao@gzu.edu.cn。

Q812

A