虫草素抗炎作用及机制研究*
2016-08-16孙佳瑜廖康汉单爱云
李 晖,孙佳瑜,廖康汉,王 喆,单爱云
(1.深圳市南山区医院,深圳 518067;2.深圳市福田区中医院,深圳 518033;3.中南大学湘雅医学院,长沙 410013)
·中药研究·
虫草素抗炎作用及机制研究*
李晖1,孙佳瑜2,廖康汉1,王喆3,单爱云2
(1.深圳市南山区医院,深圳518067;2.深圳市福田区中医院,深圳518033;3.中南大学湘雅医学院,长沙410013)
[目的]研究虫草素抗炎作用及机制。[方法]通过二甲苯致小鼠耳肿胀实验研究虫草素不同剂量(50、100、200 mg/kg)对耳肿胀的抑制作用,在细胞水平研究虫草素(12.5、25、50 μmol/L)对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶-2(COX-2)表达和一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)产生的影响。[结果]虫草素(200 mg/kg)能够抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(P<0.05)和耳片中一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的产生(P<0.05)。在细胞水平虫草素(25、50 μmol/L)能够抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶-2(COX-2)表达(P<0.05),一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的产生(P<0.05)。[结论]虫草素具有抗炎作用。
虫草素;抗炎;一氧化氮;前列腺素E2;诱导型一氧化氮合酶;环氧酶-2
虫草素即3'-脱氧腺苷(3'-deoxyadenosine)为核苷酸的衍生物,属于嘌呤碱,天然存在于冬虫夏草和蛹虫草(北虫草)中,是主要活性成分,为白色针片状结晶,其分子量为251.24。由苏格兰科学家Cunningham等在1951年首次从蛹虫草原浆液中分离得到[1],自从虫草素发现以来,国内外学者对其进行广泛研究,发现虫草素具有广泛药理作用和生物活性,研究中发现虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等多种药理作用[2-7],对于虫草素的研究与开发,一直是国内外学者研究的热点,笔者主要通过建立体内外炎症模型研究虫草素抗炎作用和相应机制。
1 实验药品、材料与动物
1.1药品与试剂主要化学药品和试剂虫草素(C3394,Sigma公司,美国),脂多糖(055:B5 L4005 sigma公司美国),前列腺素 E2检测试剂盒(minneapolis,MN,美国),一氧化氮检测试剂盒(南京建成),COX-2和iNOS一抗(CST,美国),二抗和β-actin(Santa cruz,美国),DMEM细胞培养液(Corning,美国),胎牛血清(Hyclone,美国)
1.2实验动物与细胞BALB/c小鼠,50只,体质量18~22 g,广东省医学实验动物中心提供。饲养环境为SPF级。随机分笼饲养。巨噬细胞RAW264.7细胞购买于协和医科大学细胞库。
2 实验方法
2.1实验分组将50只BALB/c小鼠随机分为五组,分别为对照组、阳性药物组、虫草素高、中、低剂量组,给药途径为腹腔注射,对照组给等体积的生理盐水、阳性药物为赖氨匹林给药剂量为100mg/kg,虫草素高、中、低给药分别为50、100、200 mg/kg,虫草素超声溶解在生理盐水中,每日给药1次,连续给药7 d。
2.2二甲苯致小鼠耳肿胀各组小鼠末次给药后0.5 h,用二甲苯(200 μL/耳)均匀涂抹于小鼠右耳廓内外两侧致急性炎症,20 min后用小鼠耳廓打孔器将小鼠左右耳冲下等面积耳片,称质量后以自身的右左耳质量之差表示肿胀度。
肿胀度=自身右耳片质量-自身左耳片质量
2.3耳片组织中NO和PGE2的含量测定将各组冲下来的耳片组织液氮冷冻后加入适量PBS仔细研磨,低温离心取上清[8],分别检测研磨后组织上清液中NO和PGE2的含量。
2.4虫草素对NO和PGE2产生的影响将RAW264.7细胞按密度5×106/孔平均铺于6孔板中,24 h后将不同浓度虫草素(12.5、25、50 μmol/L)和LPS(2 μg/mL)共孵育12 h,取细胞上清液,测其上清液中NO和PGE2的含量[8],测定每孔细胞总蛋白量作为对比。
2.5虫草素对iNOS和COX-2表达的影响将RAW264.7细胞按密度5×106/mL平均铺于6 cm平皿中,24 h后将不同浓度虫草素(12.5、25、50 μmol/L)和LPS(2 μg/mL)共孵育12 h后,提取每皿细胞总蛋白用免疫印迹检测iNOS和COX-2的表达情况[9]。
3 数据处理
4 实验结果
4.1虫草素对小鼠耳肿胀的影响二甲苯致小鼠耳肿胀实验中,阳性药物赖氨匹林100 mg/kg给药后小鼠耳肿胀度为(6.21±1.81)mg(P<0.01);虫草素低、中、高3个剂量(50、100、200 mg/kg)后小鼠耳肿胀度分别为(12.34±1.58)mg、(11.67±1.73)mg和(6.92± 1.82)mg(P<0.05);虫草素高剂量组与模型组比较有统计学差异,与阳性药物赖氨匹林作用大致相当,但中低剂量组对其肿胀没有抑制作用,见图1。
图1 虫草素对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of Cordycepin on xylene-induced ear swelling in mice
4.2虫草素对小鼠耳片中NO和PGE2含量的影响取耳片组织匀浆后上清液,检测上清液中的NO和PGE2含量,实验结果提示,腹腔注射赖氨匹林100 mg/kg后小鼠耳片中NO的含量为(8.14± 1.35)μmol/g(P<0.05),PGE2的含量为(122.45± 8.72)mg/L(P<0.01);虫草素低、中、高3个剂量(50、100、200 mg/kg)腹腔注射后小鼠耳片中NO分别为(14.25±1.81)μmol/g、(13.13±1.25)μmol/g和(9.15± 1.67)μmol/g(P<0.05),见图2,PGE2的含量分别为(238.52±13.54)mg/L、(222.17±10.12)mg/L、(132.15± 12.17)mg/L(P<0.05)(见图3),虫草素低、中剂量组对NO和PGE2的影响与模型组比较没有统计学差异,高剂量组与阳性药物大致相当。
4.3虫草素对细胞NO和PGE2产生的影响LPS刺激RAW264.7细胞后,NO和PGE2的含量分别为(45.26±2.53)μmol/L和(90.96±2.68)mg/L与正常组比较有统计学差异(P<0.001)。虫草素3个剂量(12.5、25、50 μmol/L)给药后NO的含量分别为(40.7±2.35)μmol/g、(29.35±2.18)μmol/g(P<0.05)和(22.13±2.95)μmol/g(P<0.01),低剂量组的虫草素与模型组比较没有统计学差异(见图4);PGE2的含量分别为(88.27±2.93)mg/L、(60.97±2.51)mg/L (P<0.05)和(50.13±2.62)mg/L(P<0.05),低剂量组的虫草素与模型组比较无统计学差异(见图5)。
图2 虫草素对小鼠耳片一氧化氮的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in mice ear
图3 虫草素对小鼠耳片前列腺素E2的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2 production in mice ear
4.4虫草素对细胞培养iNOS和COX-2表达的影响LPS刺激RAW264.7细胞建立细胞炎症模型,其iNOS和COX-2表达量与正常组比较有统计学差异(P<0.001)。不同浓度的虫草素(12.5、25、50 μmol/L)与LPS共刺激RAW264.7细胞后,中高剂量组与LPS刺激的模型组比较有统计学差异(P<0.05),结果提示虫草素能够抑制与炎症相关的iNOS和COX-2蛋白的表达。见图6,图7。
图4 虫草素对RAW264.7细胞一氧化氮产生抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of Cordycepin on NO production in RAW264.7 macrophages
图5 虫草素对RAW264.7细胞前列腺素E2产生抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of Cordycepin on PGE2production in RAW264.7 macrophages
5 讨论
图6 RAW264.7细胞虫草素对iNOS表达的影响Fig.6 Effects of Cordycepin on iNOS expression in RAW264.7 macrophages
图7 RAW264.7细胞虫草素对COX-2表达的影响Fig.7 Effects of Cordycepin on COX-2 expression in RAW264.7 macrophages
虫草素又称蛹虫草菌素,是冬虫夏草和蛹虫草里的活性成分,也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素,具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和调节免疫等多种生物活性[10],自从虫草素发现以来,其广泛的药理作用和生物活性成为国内外研究的热点,开发前景广阔。炎症是机体对于致炎因子的防御性反应,炎症细胞和炎症介质参与的一些列的病理生理反应,在炎症反应中毛细血管通透性增加,炎性细胞趋化游走,炎性介质释放[11]。在炎症反应中,NO和PGE2是重要的炎性介质,参与和介导炎性反应,过量的产生NO和PGE2都会加重炎症反应对机体的损伤。研究认为NO是体内重要的细胞因子,参与包括有血管舒张、血小板聚集、神经传递、抗癌抗菌等过程,尤其是在炎症反应中能够介导产生炎症因子,如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1等,具有细胞毒作用加剧炎症反应[12-13],PGE2是重要的炎症介质之一,在炎症早期,PGE2能够促进血管舒张和增加神经对疼痛的敏感性,会增加炎症组织水肿和疼痛,同时也会增加其他炎症介质的作用如缓激肽的作用[14-15],目前普遍认为NO和PGE2均参与炎症反应,加重炎症反应对机体的损伤,与急慢性炎症有密切的关系[16-17],因此,抑制NO和PGE2的产生能够抑制炎症反应,减少炎症对机体的损伤,是抗炎的主要途径之一。iNOS和COX-2是产生NO和PGE2的限速酶[9],抑制iNOS和COX-2蛋白的表达,能够抑制了NO和PGE2的产生,发挥抗炎作用。本研究中通过二甲苯诱导小鼠耳肿胀建立急性炎症模型,给予浓度梯度虫草素发现能够抑制小鼠的耳肿胀以及炎性组织中NO和PGE2的产生,提示虫草素具有抑制炎症的作用,同时在RAW264.7细胞上,用LPS刺激建立细胞炎症模型,给予虫草素,实验结果提示虫草素能够抑制炎性相关蛋白iNOS和COX-2的表达和NO和PGE2的产生,综上所述,提示虫草素具有抗炎作用,虫草素的抗炎作用可能是通过抑制iNOS和COX-2的表达和相应的NO和PGE2的介导的。本实验研究表明虫草素具有抗炎的作用,这为虫草素的进一步的研究与开发提供了科学依据。
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(本文编辑:高杉,张震之)
Anti-inflammatory effect and mechanism study of Cordycepin
LI Hui1,SUN Jia-yu2,LIAO Kang-han1,WANG Zhe3,SHAN Ai-yun2
(1.Shenzhen Nanshan District Hospital,Shengzhen 518067,China;2.Shenzhen Futian District Traditional Chinese Medicine Hospital,Shengzhen 518033,China;3.Central South University Xiangya School of Medicine,Changsha 410013,China)
[Objective]To study the anti-inflammatory effect of Cordycepin.[Methods]By Xylene induce ear swelling test in mice,the inhibition of Cordycepin(50,100,200 mg/kg)was evaluated for ear swelling.At the cellular level,the effect of Cordycepin(12.5,25,50 μmol/L)was evaluated for iNOS and COX-2 expression,NO and PGE2production.[Results]Cordycepin(200 mg/kg)inhibited ear swelling of mice(P<0.05),NO and PGE2production in mouse ear piece(P<0.05).At the cellular model,Cordycepin(25,50 μmol/L)inhibited iNOS and COX-2 expression(P<0.05),NO and PGE2production(P<0.05).[Conclusion]Cordycepin have anti-inflammatory effect.
Cordycepin;anti-inflammation;NO;PGE2;iNOS;COX-2
R285.5
A
1672-1519(2016)05-0303-04
10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.12
国家自然科学基金项目(81470016),深圳市科技研发基金项目(NJCYJ20140414145007216)。
李晖(1982-),男,主管药师,主要从事中药药理研究。
单爱云,E-mail:1348903@qq.com
2016-02-23)