水稻抗二化螟特性鉴定技术的评价研究

刘显波　谢黎虹　唐绍清　凃巨民　胡培松　罗炬（中国水稻研究所，杭州30006；浙江大学，杭州30000；通讯作者：luojurice@6.com）

水稻抗二化螟特性鉴定技术的评价研究

刘显波1谢黎虹1唐绍清1凃巨民2胡培松1罗炬1*
（1中国水稻研究所，杭州310006；2浙江大学，杭州310000；*通讯作者：luojurice@126.com）

采用离体叶片、离体茎秆、离体剥开茎秆及活体成株4种室内抗虫性鉴定方法，对相同水稻材料进行抗二化螟特性鉴定，同时对这些水稻室内抗二化螟鉴定技术进行了综合评价。结果表明，这些方法的抗性鉴定结果高度吻合，离体叶片鉴定方法是目前最快速、有效的抗二化螟鉴定方法。并通过离体叶片和活体成株鉴定方法对转Vip3A基因水稻材料进行鉴定，再次验证了离体叶片鉴定方法的有效性。此外，初步发现对于同为鳞翅目水稻害虫稻纵卷叶螟，用离体叶片鉴定方法也可进行有效鉴定。

水稻；二化螟；抗性鉴定；技术评价

水稻是我国主要的粮食作物，近20年水稻播种面积占全国粮食播种面积的比例一直稳定在27%～28%，水稻总产占全国粮食总产的1/3以上（数据来源于中国国家统计局，http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj），超过一半以上的人口以稻米为主食，水稻的高产稳产对保障我国粮食安全至关重要。稻飞虱、二化螟和稻纵卷叶螟是我国水稻生产中最主要的害虫，常年给水稻造成巨大的产量损失，2001-2004年间全国水稻病虫害发生面积超过850万hm2次，其中，2003年稻飞虱、稻纵卷叶螟、水稻螟虫发生面积占病虫害总发生面积的72.5%［1］。据全国农业技术推广服务中心统计，自2003年大爆发以来稻纵卷叶螟年发生2 000万hm2次以上，自2000年来螟虫的危害维持在2 000万hm2次左右。农药的大量使用造成了环境污染、生产成本增加。因此，培育抗虫（稻飞虱、二化螟和稻纵卷叶螟等）水稻新品种并应用于生产是解决上述问题最经济有效的途径。而建立水稻材料抗虫性的有效鉴定体系是进行抗虫育种的根本基础。

二化螟Chilosuppressalis（Walker）属于钻蛀性害虫，在水稻分蘖期危害造成枯鞘、枯心苗，在穗期危害造成伤株和白穗，系水稻3个主要害虫之一；然而对水稻抗二化螟特性的高效准确鉴定难度大，其原因主要有：幼虫容易转株为害、试验中易发生逃逸；接虫时二化螟的活性强弱、受鉴水稻材料的发育阶段以及环境条件如温度、湿度等诸多因素影响，试验条件难以保证高度一致；鉴定操作流程多且复杂，易出现偏差。早在1985年国际水稻研究所提出了活体成株抗虫鉴定方法和抗级标准［2］；2000年叶恭银等提出利用离体叶片用于转苏云金杆菌毒蛋白基因水稻的二化螟鉴定，研究发现，鉴定结果与活体成株鉴定法所取得的结果相吻合［3］；2002年姚青等发明了离体稻株抗二化螟鉴定技术，该方法可靠而且准确［4］。2010年四川省制定“水稻抗二化螟鉴定技术规程”地方标准（DB51），包括田间鉴定和离体茎秆鉴定方法［5］，这些鉴定方法各有优缺点。由于是不同的研究者利用不同的材料在不同的时期用不同的方法进行室内抗虫性鉴定，鉴定方法和鉴定结果的有效性需要进一步明确［6］。鉴于此，笔者利用同一批水稻材料，采用离体叶片、离体茎秆、离体剥开茎秆及活体成株等多种室内抗虫性鉴定方法进行抗虫性鉴定比较，以期对这些水稻室内抗二化螟鉴定技术进行综合评价，为有效鉴定和评价水稻抗二化螟能力提供技术支撑。同时，选择综合评价最优方法对同为鳞翅目水稻害虫稻纵卷叶螟进行抗虫性鉴定，以期找到一种方便快捷的稻纵卷叶螟抗虫性鉴定方法。

1　材料与方法

1.1供试虫准备

供试验用二化螟卵块购自中国农业科学院植物保护研究所。将购买的卵块置于培养皿中，保持一定的温度（25℃～28℃）和湿度（RH 80%～90%），直至孵化，取刚刚孵化的幼虫供正式试验用。稻纵卷叶螟幼虫及虫卵在中国水稻研究所富阳实验基地试验田内采集。

1.2供试水稻材料

供试水稻材料包括台中在来1号（简称TN 1，感虫对照）、转cry1Ab/1Ac基因水稻华恢1号（抗虫对照）及其非转基因受体材料明恢63、转Vip3A基因水稻及其非转基因受体材料日本晴。

1.3试验地点及种植方式

试验在中国水稻研究所富阳转基因中试基地进行，供试水稻材料5月25日播种，单本分别移栽至大田和塑料桶中，大田每个材料种植4行8株，每个材料种植25个塑料桶。整个生育期间不施任何杀虫剂。

1.4华恢1号阳性株鉴定

取华恢1号水稻叶片放置于1.5 mL离心管中研磨，并以蒸馏水抽提和稀释，将Cry1Ab/1Ac胶体金免疫检测试纸条（美国一龙公司）插入样品液，5min后观察结果。在试纸条上出现1条检测线和1条质控线为阳性（含毒蛋白），记为“+”；仅出现1条质控线为阴性（无毒蛋白），记为“-”。

1.5抗螟性鉴定方法

1.5.1离体叶片法

参考农业部发布的《转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻抗虫性鉴定标准》（农业部953公告-8.1-2007）中的方法，在水稻分蘖中期，分别从各供试材料的单本种植的稻株中，随机从3个分蘖上剪取3～4 cm长的叶片（倒1叶）各1片。随后在叶片两端压上用0.1 g/L苯并咪唑保鲜液浸渍过的小滤纸片，将叶片移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）内径，然后每管分别接入12头蚁螟（二化螟或稻纵卷叶螟），管口塞紧脱脂棉花。第4天向管内添加新鲜供试叶片2～3片，自开始接虫后第7天检查叶片，记录幼虫存活数，对每个玻璃管的活虫体质量进行称量。每个株系鉴定10株，2次重复。

根据试虫存活情况，计算各供试材料每个株系的试虫死亡率，并参照感虫对照的平均试虫死亡率计算试虫校正死亡率和平均校正死亡率，根据校正死亡率划分抗、感等级，评价供试材料的抗二化螟或稻纵卷叶螟特性。校正死亡率=（供试材料试虫死亡率-感虫对照试虫平均死亡率）/（1-感虫对照试虫平均死亡率）× 100。分级标准：

级别抗性幼虫校正死亡率

0级HR（高抗）>80%

1级R（抗）60.1%～80%

3级MR（中抗）40.1%～60%

5级MS（中感）20.1%～40%

7级S（感）＜20%

9级HS（高感）全部死亡

1.5.2离体茎秆法

取分蘖盛期的主分蘖稻苗2根，把稻苗擦干，将2根稻苗截取成包含叶鞘的5 cm茎秆2根，随后在茎秆两端压上用0.1 g/L苯并咪唑保鲜液浸渍过的小滤纸片。然后每根茎秆分别接入6头二化螟蚁螟，将2根茎秆移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）内径，管口塞紧脱脂棉花。接虫后第7天分别考查或测定幼虫死亡率和活虫体质量。其间，于第3天在茎秆两端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鲜液浸渍过的小滤纸片确保茎秆湿润。每个株系鉴定5株，2次重复。结果统计和评价标准同离体叶片法。

1.5.3离体剥开茎秆法

取分蘖盛期的主分蘖稻苗2根，把稻苗擦干，将2根稻苗截取成包含叶鞘的5 cm茎秆2根，将茎秆剥开，用细毛笔轻轻将12头二化螟蚁螟接种在剥开的茎秆中（每个茎秆接虫6头），随后在茎秆两端压上用0.1 g/L苯并咪唑保鲜液浸渍过的小滤纸片，将茎秆移置小平底玻管（9.5 cm×1.5 cm）内径，管口塞紧脱脂棉花。接虫后第7天分别考查或测定幼虫死亡率和活虫体质量。其间，于第3天在茎秆两端增加用0.1 g/L苯并咪唑保鲜液浸渍过的小滤纸片确保茎秆保湿。每个株系鉴定5株，2次重复。结果统计和评价标准同离体叶片法。

1.5.4活体成株抗虫性鉴定法

参照国际水稻研究所抗虫鉴定方法，将种植在塑料桶中且带2～3个分蘖的稻株搬至温室，用细毛笔轻轻将二化螟蚁螟接种在夹于茎秆与叶鞘之间的叶舌处，每株接10头，并加塑料网罩（直径20 cm，高70 cm）。接虫后2周移去网罩。接虫后15 d、30 d考查各稻株中有无枯心，调查枯心率和枯心指数。每个株系鉴定10株，2次重复。枯心率（%）=单株枯心数/单株分蘖数。参照Heinrichs［2］温室鉴定二化螟抗性按枯心指数进行分级评定。抗性标准：

级别抗性枯心指数

0级HR（高抗）无害

1级R（抗）＜20%

3级MR（中抗）20.1%～40%

5级MS（中感）40.1%～60%

7级S（感）60.1%～80%

9级HS（高感）>80%

2　结果与分析

2.1华恢1号转基因阳性检测

在移栽至大田和塑料桶1周后，对抗虫转基因水稻华恢1号所有的单株进行转基因阳性检测，剔除阴性单株，防止阴性单株与阳性单株抗虫性差异造成的试验误差。选取阳性单株进行抗虫性鉴定，结果见图1。

2.24种室内抗虫鉴定方法的吻合性比较

表1　利用离体叶片、离体茎秆和离体剥离茎秆法对水稻材料抗二化螟特性评价结果

表2　利用活体成株鉴定法对水稻材料进行二化螟抗性评价结果

表3　利用离体叶片鉴定法对水稻材料抗稻纵卷叶螟特性评价结果

图1　华恢1号的Cry1Ab/1Ac蛋白检测结果

分别利用离体叶片、离体茎秆、离体剥开茎秆鉴定技术对感虫对照TN1、抗虫对照华恢1号及常规稻明恢63等3份水稻材料进行抗二化螟特性鉴定，结果如表1。从表1可以看出，感虫对照TN1各重复均表现为不抗二化螟，表现稳定；以TN1作为参照，抗虫对照华恢1号的校正死亡率为100%，表现为高抗二化螟；而常规稻明恢63 3种鉴定方法的平均校正死亡率在3.44%～13.56%之间，表现为感二化螟，方差分析表明，3种鉴定方法结果无显著差异。利用活体成株鉴定方法对同样3个品种进行二化螟抗性评估，结果见表2。从表2可见，TN1枯心率达100%，华恢1号未发现枯心，分别表现为高感和高抗二化螟，与离体叶片法、离体茎秆法、离体剥开茎秆法鉴定结果相吻合；常规稻明恢63接虫后第15天和第30天的枯心率分别为62.5%和72.5%，表现为感二化螟，与上述3种鉴定方法的结果相同。总体而言，4种鉴定方法均适宜用于水稻抗二化螟特性的评价，鉴定结果无明显差异。

2.3对稻纵卷叶螟的抗性评价

利用离体叶片鉴定方法对感虫对照TN1、抗虫对照华恢1号及常规稻明恢63等3份水稻材料进行抗稻纵卷叶螟特性鉴定，结果与抗二化螟特性鉴定结果一致，以TN1作为参照，抗虫对照华恢1号的评价校正死亡率为100%，表现为高抗稻纵卷叶螟，而常规稻明恢63平均校正死亡率为3.85%，表现为感稻纵卷叶螟（表3）。因此，对转Bt抗虫水稻的稻纵卷叶螟抗性鉴定可利用离体叶片鉴定方法进行鉴定。

2.4转Vip3A基因水稻材料抗虫性检测

利用离体叶片鉴定法和活体成株鉴定法对转Vip3A基因水稻材料进行抗二化螟特性鉴定，除感虫对照品种TN1外，转Vip3A基因水稻材料和对照日本晴在接虫30 d后的枯心率均略高于接虫15 d的枯心率（表4），表明接虫15 d后二化螟的危害在继续扩展。因此，抗二化螟的特性分析以接虫30 d的枯心率结果为准，其中，明恢63在接虫15 d和30 d的枯心率的差异也有相同反应（表2）。2种鉴定方法鉴定结果表明，13GV-12、13GV-18、13GV-30表现为高抗二化螟，抗二化螟能力均优于非转基因对照品种日本晴，GV-2、GV-38、GV-48、GV-54、GV-63、GV-81表现为感或中感二化螟，与对照日本晴抗二化螟能力相仿，再次验证离体叶片鉴定方法与活体成株鉴定方法的研究结果相一致。

表4　利用离体叶片鉴定法和活体成株鉴定法对转Vip3A水稻材料抗二化螟特性评价结果

3　小结与讨论

目前常用的抗虫性鉴定方法主要包括田间抗虫性鉴定和室内抗虫性鉴定。田间抗虫性鉴定是在自然条件下进行，方法简便，真实感强，但易受田块中虫口密度不均匀、被检测群体大小（及重复数）、气候条件（如温度、湿度等）甚至鸟兽危害等多方面因素影响，鉴定结果容易出现偏差。室内抗虫性鉴定环境可以控制或保护，采取人工接虫，方法易规范，结果可比性强、重复性好，但对于离体材料（叶、茎秆等）存在保鲜、供试虫龄、适宜的被检测群体、后期剥检查虫工作量大等问题，相对于室外抗虫性鉴定，离体抗虫性鉴定的检测成本较高，过程较烦琐，这种方法适宜有条件的单位在需对水稻材料抗虫性准确鉴定的情况下使用。研究结果表明，对水稻抗二化螟特性鉴定采取离体叶片法、离体茎秆法、离体剥开茎秆法鉴定与活体成株法鉴定的结果完全吻合。离体叶片鉴定法具有快速、简便、不损伤稻株、后期容易剥检查虫的优点。对于离体茎秆鉴定剥开与否，试验证明对二化螟的存活和生长无明显差异，但对鉴定后期剥检查虫而言，离体剥开茎秆鉴定法更容易造成二化螟钻入茎秆内鞘内部，由于为害后期茎秆颜色与幼虫体色相近，容易漏检虫数，从而造成数据偏差，而离体茎秆中的幼虫主要存在于茎秆内鞘。总体而言，离体叶片鉴定法是目前最快速、有效的抗二化螟鉴定方法。另外，离体鉴定法中供试虫龄，以刚刚孵化6 h以内的蚁螟为宜。运用离体叶片鉴定法测定水稻抗稻纵卷叶螟和抗二化螟的结果一致，对转Bt抗虫水稻的稻纵卷叶螟抗性鉴定可以利用离体叶片鉴定法进行鉴定。由于稻纵卷叶螟和二化螟同属于鳞翅目害虫，且对Bt蛋白更加敏感，初步判断对于转Bt抗虫水稻的稻纵卷叶螟抗性鉴定可以参照其二化螟抗性鉴定结果进行评估，结论是否成立可以通过进一步增加测试品种进行验证。

［1］王艳青.近年来水稻病虫害发生及趋势分析 ［J］.中国农学通报，2006，22（2）：343-347.

［2］Heinrichs E A,Medrano F G,Rapusas H R.Genetic evaluation for insect resistance in rice［J］.Manila,Philippines:International Rice Research Institute,1985.

［3］叶恭银，胡萃，舒庆尧，等.转苏云金杆菌毒蛋白基因水稻抗螟性的离体叶片测定法［J］.植物保护学报，2000，27（1）：1-6.

［4］姚青，赖凤香，张志涛.水稻抗二化螟特性离体稻株鉴定技术［J］.中国水稻科学，2002，16（4）：385-386.

［5］四川省地方标准DB51/T1056-2010.水稻抗二化螟性鉴定技术规程［S］.

［6］张志涛.水稻品种抗虫性鉴定技术概述［J］.国外农学-水稻，1986 （6）：1-7.

Evaluation of Appraisement Method for Rice Resistance to Striped Stem Borer

LIU Xianbo1,XIE Lihong1,TANG Shaoqing1,TU Jumin2,HU Peisong1,LUO Ju1*
（1China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China；2Zhejiang University,Hangzhou 310000,China；*Corresponding author:luojurice@126.com）

The identification result was consistent with the resistance evaluation to striped stem borer through four different bioassay methods,including detached-leaf bioassay,detached-stem bioassay,stripping detached-stem bioassay and whole plant bioassay.The detached-leaf bioassay is considered as the most rapid and effective method for evaluating resistance ability to striped stem borer.By both detached-leaf and whole plant bioassays,the author identified transgenic rice with Vip3A gene,and further validated the identification effectiveness of the detached-leaf bioassay method.Simultaneously,our preliminary results revealed that detached-leaf bioassay could also perform an accurate identification to rice leaf roller as lepidoptera pests of rice.

rice；striped stem borer；resistance evaluation；technology appraisement

S511；S435.112+1

A

1006-8082（2016）04-0035-04

2016-02-25

农业部转基因重大专项（2014ZX08001-001，2016ZX08001-001）