鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性及作用机制研究

洪　军，胡建业，韩　莎，张　侠，孔　丽，白玉珍，王　陶

(河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山 467036)



鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性及作用机制研究

洪军*，胡建业，韩莎，张侠，孔丽，白玉珍，王陶

(河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山 467036)

摘要：为探讨鲎素对嗜水气单胞菌的抑杀作用，采用最小抑菌浓度、AB染料、扫描电镜、流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳等方法研究鲎素对嗜水气单胞菌的抗菌活性、杀菌率、胞内紫外物质泄露、膜负电荷数、外部形态结构及胞内基因组DNA的影响。结果表明，鲎素对嗜水气单胞菌的抗菌活性较其他细菌弱；2倍最低杀菌浓度(MBC)鲎素能在短时间内迅速杀死嗜水气单胞菌并导致胞内生物大分子泄漏；扫描电镜发现1倍MBC鲎素能导致轻微的壁膜破损及一些胞内物质渗出和粘连；流式细胞仪结果表明，1倍MBC鲎素能破坏细胞膜的完整性；AB染料测定表明鲎素处理后能改变膜负电荷数；琼脂糖凝胶电泳表明，鲎素能够与嗜水气单胞菌的基因组DNA发生作用，并呈浓度依赖关系，浓度越高对细菌基因组DNA损伤越大。鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性弱，只有高浓度时才能短时间内导致胞内紫外吸收物质泄露、膜负电荷数发生改变及基因组DNA损伤。关键词：鲎素；嗜水气单胞菌；生物学活性；抗菌机制

鲎素(tachyplesin I)是从中国鲎血细胞的酸性提取物中分离出来的一种具有典型环状β-折叠结构的阳离子抗菌肽[1]。研究发现，鲎素具有广谱抗菌活性，可抑杀细菌、真菌、病毒、原虫和藻类，还具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化的作用。目前已证实鲎素具有多个作用靶点，如细胞壁膜、脂多糖、胞内二级作用靶点，并通过协同机制发挥作用[2-4]。作为最具潜力的抗生素的替代品之一，鲎素已作为抗菌药物、饲料添加剂等应用于医药和养殖业等领域[5-6]。

嗜水气单胞菌是一种常见的鱼类致病菌，对水产养殖业危害很大，也是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。目前对该菌的控制主要依赖抗生素、化学药物以及疫苗。我国水产养殖中抗菌药物的长期使用或滥用所引起的病原菌耐药性问题严重，对水产养殖业造成了巨大的经济损失。喹诺酮类药物作为一种广谱高效的抗菌药物，目前已广泛应用于水生动物的疾病治疗[7]。但是在治疗鱼病中发现喹诺酮类药物的用量呈逐年增长的趋势。针对抗生素药物施用后会产生药物残留的问题[8]，国内外对抗菌肽的研究已经成为热点[9-10]。因鲎素分子量小，不易产生药物残留，是一种绿色环保型抗菌药物，鲎素能否抑制或杀灭嗜水气单胞菌用于水产养殖，相关研究报道较少。因此，本研究拟通过鲎素对嗜水气单胞菌的抑杀作用研究，旨在为该菌引起的暴发性出血性鱼病的防控提供科学的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌种嗜水气单胞菌XS91-4-1为中国科学院水生生物研究所李爱华研究员分离保藏菌株；铜绿假单胞菌CCTCC2620购于中国典型培养物保藏中心；嗜水气单胞菌GIM1.172和大肠埃希菌ATCC25922购于广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2药物鲎素由吉尔生化(上海)有限公司合成，纯度为95%以上；盐酸左氧氟沙星由康普药业有限公司提供。

1.1.3培养基TSA培养基是培养嗜水气单胞菌的专用培养基，其他菌株用牛肉膏蛋白胨培养基。

1.1.4主要试剂DNA提取试剂盒、DL 10 000,宝生物工程(大连)有限公司产品；AB染料,Sigma公司产品；琼脂糖,北京赛百奥科技有限公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1鲎素的抗菌活性测定采用微量肉汤稀释法测定鲎素的最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，此方法参照文献[4]方法。采用微量肉汤稀释法测定鲎素的MIC，在无菌的96孔平板中制备好菌液与鲎素的混合物后，恒温摇床培养20 h，用DG5033A型酶联免疫检测仪在490 nm下对平板进行扫描，鲎素的MIC值确定按照低于50%对照孔(11孔)生长以上的最小质量浓度计算鲎素的MIC值。从未见浑浊的孔中取3个对照，每次20 μL，涂布到LB琼脂平板上，适宜温度培养20 h，确定MBC。1.2.2鲎素对嗜水气单胞菌的杀菌率测定取过夜培养的嗜水气单胞菌菌液，用新鲜的TSA培养基调整菌液密度为1×108CFU/mL，鲎素处理后终浓度为160 μg/mL，对照组用培养基替代。在28 ℃分别培养30、60、90、120 min后，根据菌液浓度分别稀释到适宜比例，然后取100 μL稀释后的菌液涂于固本培养基平板上，28 ℃培养24 h后计算存活的菌落数。细菌成活率%=(鲎素处理后的存活细胞数/未加鲎素的存活细胞数)×100。

1.2.3鲎素对嗜水气单胞菌的紫外吸收泄漏检测取过夜培养12 h的嗜水气单胞菌菌液(约为1×109CFU/mL)，用0.1 mol/L(pH 7.4)磷酸盐缓冲液稀释为1×107CFU/mL。用终浓度为160 μg/mL鲎素的菌悬液于28 ℃分别孵育30、60、90、120、150、180 min，相同条件下以未加鲎素的菌悬液为对照。处理后样品分别经0.22 μm滤膜过滤，滤液于紫外分光光度计260 nm波长测定其吸光值。

1.2.4鲎素对嗜水气单胞菌外部形态的影响将待测细菌接种固体琼脂平板上，28 ℃恒温培养，取单个菌落，用无菌生理盐水制成菌悬液，调整细菌浓度为1.5×108CFU/mL。取不同梯度浓度的鲎素(0、1 MBC)对菌液轻轻混均后，置恒温摇床上(150 r/min)孵育30 min。每个处理2个重复。取上述处理的菌液，室温下4 000 r/min离心5 min，收集菌体。然后加入适量0.1 mol/L的PBS缓冲液洗涤菌体两次，4 000 r/min离心3 min收集菌体，加入1 mL戊二醛(40 mL/L)固定液，混匀菌体，于4 ℃固定过夜。1.2.5鲎素对嗜水气单胞菌的膜损伤的影响接种过夜培养细菌至新鲜培养基,摇床培养1 h ～2 h，当OD 600 nm=0.4左右时，分别加入终浓度为0和80 mg/L鲎素，28℃孵育60 min。离心收集菌体，PBS洗涤两遍后重悬菌液，加入30 mmol PI/L染色液，冰上孵育10 min，5 000 r/min离心5 min收集细胞，用无菌PBS缓冲溶液洗涤2次去除过量的PI。

每份悬液检测1×104～3×104个细胞，采用488 nm激光激发，PI标记细胞在635 nm发射红色荧光在流式细胞仪上检测。数据采集后用Cell Quest Pro软件进行分析[11]。

1.2.6鲎素对嗜水气单胞菌的膜电荷数检测

1.2.6.1AB染料标准线的制作参照文献[12]方法进行，称取AB 标准品 4.300 mg，用双蒸水配成0.250 mg/mL的溶液，并等倍稀释成0.125、0.063、0.030、0.015、0.008 mg/mL 系列浓度梯度的溶液。在测定OD 650 nm对吸光度-浓度(OD-C)作图制成标准曲线。

1.2.6.2细菌膜电荷数检测收集培养好的嗜水气单胞菌，用PBS 缓冲液洗涤细菌3 次，5 000 r/min离心10 min，再次用PBS悬浮细菌，使细菌的浓度为2.7×108CFU/mL。试验设3 组，分别为终浓度为40 μg/mL 、80 μg/mL 鲎素组和PBS 空白对照组，同时以不同浓度的盐酸左氧氟沙星作阳性对照，每组设3个重复，28 ℃温孵30 min，2 000 r/min离心3 min，弃上清，PBS 反复洗涤3 次，去除残余药物，加入PBS制成细菌悬液 0.5 mL。悬液中分别加入 0.77 mg/mL AB溶液 0.5 mL，混匀，37 ℃温孵30 min，2 000 r/min离心30 min，在酶标仪下检测其OD 650 nm值。根据标准曲线，分别计算出各样本中残余AB 浓度，然后根据公式OD 结合=OD 初-OD 残余计算出与细菌结合的AB量。1.2.7鲎素对嗜水气单胞菌的基因组DNA的影响细菌基因组的提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒进行，测定嗜水气单胞菌的基因组OD 260 nm/OD 280 nm≥1.90，纯度符合试验要求。

基因组DNA和鲎素均溶于0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)缓冲液中，保持恒定浓度的细菌基因组DNA (25 μg/mL)，与不同终浓度的鲎素(10、20、40、80、160、320 μg/mL)在37℃避光孵育60 min后，进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳，电压80 V，电流50 mA，电泳时间约90 min。

2　结果

2.1鲎素的抗菌活性测定

通过微量MH肉汤稀释法测定鲎素对嗜水气单胞菌和绿脓杆菌等的MIC和平板计数法测定的MBC见表1。

由表1可知，鲎素和盐酸左氧氟沙星对于不同细菌的MIC和MBC有一定的差别。与其他革兰阴性菌(铜绿假单胞菌和大肠埃希菌)相比，鲎素对于嗜水气单胞菌GIM1.172的抑菌活性较弱。对于鱼类致病性嗜水气单胞菌XS91-4-1在40 μg/mL鲎素时可抑制嗜水气单胞菌菌体的生长。

后续试验均采用嗜水气单胞菌XS91-4-1菌株。

表1　鲎素和盐酸左氧氟沙星对嗜水气单胞菌等菌株的抗菌活性

2.2鲎素对嗜水气单胞菌存活率的影响

鲎素作用嗜水气单胞菌后，存活率可以从宏观上反映鲎素的杀菌情况。参考表1的数据，本试验以160 μg/mL鲎素处理嗜水气单胞菌，其存活率情况如图1。

图1　160 μg/mL鲎素对嗜水气单胞菌作用

从图1可知，160 μg/mL鲎素处理嗜水气单胞菌后，在30 min内，菌体生长基本正常，成活率为93.01%，30 min后菌体生长明显受到抑制，成活率逐渐下降，90 min后成活率为7.0%左右。表明鲎素对嗜水气单胞菌的杀菌作用与时间相关，在加入鲎素的30 min～90 min之间，是菌体急剧被杀死的时间段。

2.3鲎素对嗜水气单胞菌的紫外吸收泄漏检测

依据鲎素对嗜水气单胞菌的杀菌率测定，以160 μg/mL鲎素处理嗜水气单胞菌，其胞内紫外吸收物质泄漏的情况如图2。

由图2可知，经160 μg/mL的鲎素处理嗜水气单胞菌后，在0～180 min内胞内紫外吸收物质发生明显的泄漏，0～60 min之间，泄漏量大致呈直线上升，在60 min时泄漏量接近最大值，60 min～90 min内泄漏量开始降低，直至此后90 min～120 min内泄漏量一直处于平缓的状态。未加鲎素的对照组，几乎没有紫外吸收物质的泄漏，证明细胞壁膜完整。从本试验结果可以观察到鲎素引起嗜水气单胞菌胞内紫外吸收物质泄露的数量，受作用时间的影响。鲎素对嗜水气单胞菌作用后，在短时间内能引起胞内紫外吸收物质泄漏的急剧发生，随着时间的延长泄漏量趋于平稳。 此结果也与杀菌率测定结果相一致。

图2　鲎素对嗜水气单胞菌紫外吸收物质泄漏的影响

2.4鲎素对嗜水气单胞菌外部结构的影响

为了进一步阐明鲎素对细菌表面形态的影响，用80 μg/mL鲎素孵育嗜水气单胞菌30 min后进行扫描电镜观察。结果表明，与对照组相比，1MBC浓度鲎素对嗜水气单胞菌的细胞壁膜破坏不明显，仅个别的细菌表面看到有内容物渗出(图3)。

2.5流式细胞仪检测鲎素对嗜水气单胞菌细胞膜完整性的影响

PI不能进入具有完整细胞膜的活细胞，当细胞膜不完整时，PI进入细胞，与细胞内遗传物DNA和RNA特异性结合，通常被作为细胞死亡的荧光染料标记。采用488 nm激光激发，PI标记细胞在635 nm发射红色荧光。当细胞膜通透性增强时，进入细胞内的PI增多，荧光强度就增强，根据发出荧光的强弱来判断其通透性大小。

如图4所示，80 μg/mL鲎素处理嗜水气单胞菌 60 min后，PI穿透细胞膜的百分比为52.7%。此结果表明鲎素能导致细胞膜完整性破坏，有一半的细胞膜破损。这也与扫描电镜结果一致。

2.6鲎素对嗜水气单胞菌的膜电荷数影响

AB染料标准曲线的线性方程为：y=9.372 1x-0.003 2，R2=0.997 2。AB是一种阳离子染料，能与细胞壁膜上的负电荷结合。嗜水气单胞菌在不同浓度盐酸左氧氟沙星和鲎素处理后，细胞膜的电荷数发生变化，由图5所示。在40 μg/mL鲎素处理时，膜上结合阳离子比较多，随着浓度的增高，结合阳离子浓度减少，可能因为在一定浓度内鲎素阳离子与细胞膜上阴离子结合后，通过静电引力的作用膜上去极化，鲎素进入机体杀死部分细胞，使膜上负电荷减少。

A.对照组(10 000×)；B.处理组(8 000×)

A.对照组；B.处理组

图5　鲎素(A)、盐酸左氧氟沙星(B)对嗜水气单胞菌的膜电荷数影响

而对于盐酸左氧氟沙星来说，处理嗜水气单胞菌后，能结合到细胞壁膜上的阳离子物质有减少的趋势。

2.7鲎素对嗜水气单胞菌基因组DNA的影响

为了观察鲎素与嗜水气单胞菌体外基因组DNA的相互作用，结果见图6。与泳道1对照组的DNA迁移率相比，2～7泳道的DNA迁移率逐渐减慢，可见嗜水气单胞菌基因组DNA的迁移率随加入鲎素浓度的增大而减小，而10 μg/mL～80 μg/mL浓度的鲎素对体外嗜水气单胞菌基因组DNA作用60 min后，对基因组DNA无明显阻滞现象，这可能是鲎素的浓度太低，达不到对基因组DNA的影响，但当鲎素浓度大于等于160 μg/mL时， 6、7泳道对基因组DNA条带有明显的阻滞现象，基因组DNA滞留到点样孔，仅有少部分条件出现，浓度越高，现象越明显。

M.DNA标准DL 10 000;1.对照组；2～7.10、20、40、80、160、320 μg/mL鲎素

M.DNA Marker DL10 000;1.Control group; 2-7.10,20,40,80,160,320 μg/mL tachyplesin

图6不同浓度鲎素与基因组DNA作用60 min后的电泳图

Fig.6The gel electrophoresis of different concentrations of tachyplesin I on genomic DNA for 60 min

3　讨论

关于抗菌肽杀菌机制的研究报道较多，但不同抗菌肽的作用机制差别较大，有些抗菌肽，细胞膜并不是唯一的作用靶点，还存在胞内二级作用靶点如胞内酶、蛋白质、DNA、RNA等。目前报道表明鲎素杀菌也存在胞内二级作用靶点。

本研究中，观察到鲎素作用嗜水气单胞菌后能导致菌体的胞内紫外吸收物质DNA等生物大分子的外泄。这可能是当鲎素进入菌体内，破坏细胞内大分子的结构，从而导致胞内离子的外泄，DNA和RNA等核酸物质的泄漏，这一现象也被扫描电镜和流式细胞仪的结果证实，在以往的文献报道中也有关于鲎素能导致其他细菌的胞内紫外吸收物质的泄露。本试验还发现鲎素能够使基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移率变慢，高浓度时导致DNA断裂。这也与较多关于鲎素的作用机制报道一致。关于鲎素杀菌机制的研究中，鲎素对大肠埃希菌主要通过作用于细胞质膜，能使细胞膜破裂，胞内物质外泄，高浓度时能与胞内DNA和RNA发生结合，引起细胞结构功能的破坏而导致细菌死亡[4,13]。金元宝等[11]表明鲎素能对普通变形杆菌产生抑杀作用，其抑菌机制与破坏细菌壁膜的通透性有关。这些研究能为鲎素对细菌的抑杀作用提供补充说明，也能更全面说明鲎素的广谱抗菌活性。鲎素作为一种抗菌肽，具有广谱抗菌活性，且细菌不易对其产生抗药性，通过对嗜水气单胞菌研究有助于抗菌肽应用于水产动物的养殖中。

总之，鲎素对嗜水气单胞菌的作用也主要通过与细胞膜上负电荷发生作用，并能损坏细胞膜，引起胞内物质泄露及基因组DNA损伤，但与已报道的鲎素对其他细菌抑杀作用相比，鲎素对其作用不敏感。通过本研究能为鲎素对嗜水气单胞菌感染引起的疾病的预防和治疗提供一定的理论依据。

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动物医学进展,2016,37(7):44-48ProgressinVeterinaryMedicine

收稿日期：2015-05-16

基金项目：河南城建学院科学研究基金项目(2012JBS002);国家自然科学基金项目(31540060)

作者简介：洪军(1977-)，女，河南宁陵人，副教授，博士，主要从事多肽的作用机理研究。*通讯作者

中图分类号:S941.42;Q74

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0038-06

Study on Antibacterial Activity and Action Mechanism of Tachyplesin I againstAeromonashydrophila

HONG Jun,HU Jian-ye,HAN Sha,ZHANG Xia,KONG Li,BAI Yu-zhen,WANG Tao

(CollegeofLifeScienceandEngineering,HenanUniversityofUrbanConstruction,Pingdingshan,Henan,467036,China)

Abstract:The antimicrobial role of tachyplesin I on Aeromonas hydrophila was investigated.The effects of tachyplesin on the antimicrobial activity,the sterilization rate,intracellular UV substance leakage,membrane negative charge number,external morphological structure and intracellular genomic DNA of Aeromonas hydrophila were determined by minimum inhibitory concentration,AB dye,scanning electron microscope,flow cytometry and agarose gel electrophoresis methods.Compared with other bacteria,the antimicrobial activity of tachyplesin for Aeromonas hydrophila was relatively weaker.2MBC tachyplesin could killed rapidly Aeromonas hydrophila and lead to large biological molecule leakage in a short period of time.The result of scanning electron microscopy showed that 1MBC tachyplesin could lead to membrane damage slightly and cellular content outflow.Flow cytometry results showed that 1 MBC tachyplesin can damage the integrity of cell membrane.Tachyplesin could change the membrane negative charge number through AB dye determination.Tachyplesin had effect on the genomic DNA of Aeromonas hydrophila in a concentration-dependent manner by agarose gel electrophoresis determination.Tachyplesin had weak antibacterial activity on Aeromonas hydrophila,and only high concentrations can make membrane negative charge number change,intracellular UV substance leakage and genomic DNA damage in a short time.

Key words:Tachyplesin I; Aeromonas hydrophila; biological activity; antibacterial mechanism