犬IFN-γ的原核表达及其对A型流感病毒H3N2亚型的抑制作用

秦海斌，朱海娟，朱　骞，宋珍华，温　海，贺星亮，高一龙

(公安部南京警犬研究所警犬技术公安部重点实验室，江苏南京 210012)



研究论文

犬IFN-γ的原核表达及其对A型流感病毒H3N2亚型的抑制作用

秦海斌，朱海娟，朱骞*，宋珍华，温海，贺星亮，高一龙

(公安部南京警犬研究所警犬技术公安部重点实验室，江苏南京 210012)

摘要：为研究犬的γ干扰素(IFN-γ)对犬流感病毒H3N2亚型的抑制作用，由经ConA诱导过的健康犬淋巴细胞中特异性地扩增犬IFN-γ(cIFN-γ)基因，构建重组原核表达载体pET-cIFN-γ，转化宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达，以MDCK-VSV法对纯化后产物进行抗病毒活性鉴定，并在MDCK细胞上测定对H3N2亚型犬流感病毒的抑制作用。结果表明，表达产物以包涵体形式存在，经变性、复性、纯化后，所制备犬IFN-γ的抗病毒活性为1.1×105 U/mg，重组犬IFN-γ稀释26倍后对犬流感病毒的增殖仍具有明显抑制作用。本研究成功表达了具备抗H3N2亚型流感病毒活性的犬IFN-γ，为犬流感病毒新型药物的开发奠定了基础。

关键词：犬；γ干扰素；原核表达；流感病毒

犬流感(Canine influenza，CI)是由正黏病毒科A型流感病毒属犬流感病毒(CIV)引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病，患犬临床症状表现为体温升高、流鼻液、咳嗽、食欲减退、呼吸困难等[1]。研究证实，多种来源的流感病毒均可以自然感染犬类，包括禽源H3N2亚型、H5N1亚型、H5N2亚型、H9N2亚型、禽源 H3N2重组的H3N1亚型毒株、马源H3N8亚型病毒及H3N2亚型人流感病毒等[2]。虽然只有禽源 H3N2亚型和马源 H3N8 亚型流感病毒能够在犬中水平传播并形成较稳定遗传谱系，但是由于A型流感病毒具备较强的重组变异和跨物种传播能力[3]，犬流感病毒潜在的公共卫生问题备受关注。目前犬流感防控中仍无商业化的疫苗可用[4]，也无有效的治疗药物，新型药物的开发对犬流感的防控具有重要意义[5]。

干扰素(interferon,IFN)是机体受病毒或其他诱生剂刺激巨噬细胞、淋巴细胞等而产生的一种具有高度生物学功能的糖蛋白，具有高效的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多方面的生物学活性。犬的干扰素已经在乳酸菌、酵母、家蚕等系统中获得高效表达[6-10]，其中犬IFN-α/β因为具备更有效的抗病毒活性在新型抗病毒药物中被广泛研究，但是对IFN-γ的表达和抗病毒研究相对较少，IFN-γ对犬流感病毒的抗病毒作用的研究未见报道。另外，研究发现IFN-γ除了自身的抗病毒作用之外，其免疫调节作用也有助于协同增加IFN-α/β的抗病毒效果，IFN-α/IFN-γ的联合用药也成为治疗犬流感的新思路。

本研究利用原核表达系统对犬IFN-γ进行了重组表达，并在犬肾细胞系(MDCK细胞)中测定了其对水疱性口炎病毒(VSV)及犬流感病毒H3N2亚型的抑制作用，旨在探索犬IFN-γ体外抗流感病毒活性，为进一步研发IFN-α/IFN-γ联合治疗犬流感新型药物奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞、病毒与试验用动物MDCK购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所；DH5α、DE3，TaKaRa公司产品； CIV病毒Canine/Nanjing/01/11(H3N2)株，由南京农业大学刘永杰教授惠赠；水疱性口炎病毒(VSV)由本实验室保存；试验用史宾格犬由公安部南京警犬研究所实验动物中心提供，采其外周血并分离淋巴细胞。

1.1.2主要试剂反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂、rTaq、EcoRⅠ、XhoⅠ、DNA Marker DL 5 000、T4 DNA连接酶、pMD18-T、质粒抽提试剂盒，TaKaRa公司产品；ConA，Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白，Oxoid公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成根据GenBank中登录的犬IFN-γ基因序列(Sequence ID:EF095772.1)，利用Primer 5.0设计扩增IFN-γ的特异性引物，引物两端分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点(斜体部分)，并加上保护性碱基，用于扩增IFN-γ全序列。引物由Invitrogen公司合成。

上游引物：(5′-GGCGGAATTCATGAATTA- TACAAGCTATATC-3′)

下游引物：(5′-AATCTCGAGTTATTTCGA- TGCTCTGCG-3′)

1.2.2犬IFN-γ目的基因克隆自犬外周血淋巴细胞中提取总RNA。用下游引物(P2)进行反转录合成第1链：RNA模板10 μL，5×反转录缓冲液4 μL，DNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL，P1(20 pmol/μL) 1 μL，AMV 1 μL，RNasin 0.5 μL，加至ddH2O 20 μL。反应条件：75℃ 5 min，立即冰浴5 min，然后42℃孵育1 h，95℃ 5 min。以合成的第1链为模板，按照常规方法进行PCR反应：cDNA 4 μL，10×PCR buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.8 μL，P1(20 pmol/μL) 0.8 μL，P2(20 pmol/μL) 0.8 μL，TaqDNA 聚合酶0.4 μL，加ddH2O至20 μL，立即进行PCR反应。经优化后的PCR循环参数为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，59.5℃ 1 min，72℃ 2 min，共进行40个循环；最后72℃ 10 min。反应结束后，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3重组表达载体pET-c IFN-γ的构建经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒回收，与pMD 18-T载体相连接，然后转化DH5α感受态细胞，涂布LB平板(含氨苄青霉素100 μg/mL)，37℃培养过夜，挑取单菌落，接种含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、220 r/min振摇过夜，提取质粒，酶切及PCR鉴定后，送至公司测序。取测序正确的质粒，用含酶切位点的引物扩增目的片段，酶切后与pET-32a载体连接过夜。连接产物转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃静置培养过夜。挑取白色菌落提取质粒DNA，将PCR扩增、酶切鉴定均为阳性的克隆命名为pET-c IFN-γ/BL21。

1.2.4融合蛋白的诱导表达时间的优化将pET-cIFN-γ/BL21阳性的重组菌接入2管5 mL含有1 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，每管加入50 μL，37℃、180 r/min恒温摇床培养2.5 h～3 h，测OD 600 nm约为0.4～0.6时取出。取其中一管菌液中加入5 μL 1 mg/L的IPTG；另一管不加IPTG作为对照组，37℃、180 r/min培养5 h～6 h。对加入IPTG的菌液进行以下操作：分别于3、4、5 h取1 mL样品液于1.5 mL EP管中，做好标记。培养6 h后，将2管菌液各取出1 mL，与之前样液一同13 000 r/min离心1 min，弃去上清。分别用表达的全菌、破碎后的上清及沉淀制备样品，用150 g/L的SDS-PAGE进行电泳分析，电泳结果用凝胶分析软件Band-scan分析目的蛋白的表达量。

1.2.5重组蛋白的包涵体纯化、复性、浓缩及浓度测定2 L菌液培养2 h～3 h，OD 600 nm为0.4～0.6时加入1 mg/L IPTG继续培养6 h。离心后取菌体沉淀进行超声波破碎(功率为400 W，工作5 s，间隔7 s，工作300次～400次)。包涵体沉淀用含2 mol/L脲的溶解buffer重悬，4℃、12 000 r/min离心15 min，用1.5 mL包涵体溶解buffer(含8 mol/L脲)重悬。30℃恒温水浴60 min，期间经常振荡。4℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，弃去沉淀。上清液用0.45 μm的滤膜过滤，过镍柱纯化包涵体，回收5 mL包涵体洗脱液分装在多个1.5 mL EP管中，使用BCA蛋白定量试剂盒对纯化蛋白进行蛋白定量。纯化后蛋白装入透析袋，依次放入含4 、2、1、0.75 mol/L 0脲的PBS中进行脲梯度透析，每个梯度透析4 h，将透析蛋白经PEG-6000浓缩后取出，用0.22 μm滤器过滤，收集滤液，分装，置-20℃保存。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳对纯化和浓缩效果进行分析。

1.2.6所表达犬IFN-γ活性效价测定采用微量细胞病变抑制法[11]测定重组犬IFN-γ的活性。将MDCK细胞加入96孔板中，调整细胞数至每孔约为5×105，待其生长至单层后，加入用DMEM(含50 mL/L胎牛血清)10倍倍比稀释的pET-cIFN-γ，每个稀释度设8个重复，CO2温箱中培养24 h后，加入100 TCID50的VSV 100 μL，同时设细胞阴性对照和VSV阳性对照，72 h后观察pET-cIFN-γ的抗病毒活性。以抑制半数细胞病变(CPE)的最高IFN稀释度为1个活性单位，根据Reed-Muench法计算抗病毒活性。

1.2.7所表达犬IFN-γ对CIV H3N2亚型致MDCK细胞病变的抑制作用参照文献[12]进行，以Reed-Muench法在MDCK细胞上测定CIV H3N2亚型TCID50滴度，然后对IFN-γ进行细胞毒性试验，确定其对MDCK细胞无毒性作用。在24孔细胞板上常规培养MDCK细胞，同时每孔加入100 μL 2倍系列稀释的cIFN-γ纯化物(3个重复)，37℃培养24 h形成单层MDCK细胞，然后用100 TCID50的CIV H3N2亚型接毒，72 h后观察MDCK细胞病变抑制结果。对照组不加入cIFN-γ，待MDCK细胞24 h长成单层，然后用100 个 TCID50H3N2亚型病毒接毒，72 h后观察MDCK细胞病变。

2　结果

2.1犬IFN-γ基因的PCR扩增

取PCR产物5 μL于10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，在约500 bp处见到1个明显条带，条带大小与理论值吻合，即为犬IFN-γ基因(图1)。1.犬IFN-γ基因PCR产物;2.阴性对照;M.DNA标准 DL 5 000

1.Canine IFN-γ gene PCR products;2.Negative control;M.DNA Marker DL 5 000

图1犬IFN-γ基因PCR产物电泳结果

Fig.1Electrophoresis of PCR products of canine IFN-γ gene

2.2重组表达载体pET-IFN-γ的构建

测序结果表明,PCR扩增的基因大小为515 bp，应用DNA Star分析软件分析表明与GenBank报道的犬IFN-γ基因序列(EF095772)同源性为100%。酶切结果可见，pET-32a(+)空载体的大小为5 900 bp，插入的编码犬IFN-γ的基因大小为515 bp，试验结果与理论值相符(图2)，表明重组表达载体pET-IFN-γ构建成功。

2.3融合蛋白诱导表达时间的优化

菌液经过超声波破碎后，取样液进行SDS-PAGE电泳分析，上清液几乎不含有目的蛋白，而存在于包涵体沉淀里(图3)。取出不同时段菌液进行SDS-PAGE电泳分析显示，在加入IPTG后，BL21重组菌可高效表达所需要的目的蛋白，在未添加IPTG的重组菌中，几乎不表达目的蛋白。诱导表达6 h时为蛋白表达最大量时间(图4)。经凝胶分析软件Band-scan分析，诱导6 h后表达产物占菌体总蛋白量的43.5%。

1.阳性质粒经双酶切鉴定;2.DNA标准DL 5 000

1.Positive plasmid digested byEcoRⅠ andXhoⅠ;2.DNA Marker DL 5 000

图2重组质粒pET-IFN-γ酶切鉴定结果

Fig.2Identification of recombinant plasmid pET-IFN-γ by restriction endonuclease digestion

M.蛋白分子质量标准；1.破碎后上清；2.破碎后沉淀

M.Protein molecular weight Marker；1.Supernatant after cell disruption；2.Precipitate after the cell disruption

图3蛋白存在部位

Fig.3Position of IFN-γ existed

M.蛋白分子质量标准；1.诱导表达6 h；2.诱导表达5 h；3.诱导表达4 h；4.诱导表达3 h；5.未加入IPTG的重组菌

M.Protein molecular weight Marker；1.Volume of the protein by induced expression 6 h.2.Volume of the protein by induced expression 5 h;3.Volume of the protein by induced expression 4 h;4.Volume of the protein induced expression 3 h;5.Non induced control

图4蛋白的诱导表达

Fig.4Induced expression of proteins

2.4重组蛋白的复性纯化及浓度测定

SDS-PAGE电泳分析显示，镍柱分离后在蛋白滤液和包涵体溶解buffer中只有少量目的蛋白，蛋白得到有效的回收；同时可见镍柱纯化后包涵体纯度较高(图5)。纯化后得到的蛋白浓度约为2.13 mg/mL，2 mL菌液得到总蛋白量约为4.26 mg。另外，使用不同浓度脲梯度透析，在进行到0.75 mol/L脲浓度透析时，发现蛋白有析出沉淀，经复性-透析-浓缩后，可见蛋白纯度得到进一步提升，透析-浓缩后获得的重组犬IFN-γ蛋白浓度为0.58 mg/mL。

M.蛋白分子质量标准；1.复性后蛋白；2.浓缩后蛋白；3.纯化后蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.Protein after renaturation;2.Protein after concentration;3.Protein after purification

图5蛋白复性及浓缩

Fig.5Renaturation and concentration of the protein

2.5所表达犬IFN-γ活性效价的测定

由图6结果显示，阴性对照组MDCK细胞生长良好，病毒对照组全部病变(皱缩、脱落、形成网状空斑)，而纯化的犬IFN-γ融合蛋白稀释1 000倍后仍能够抵抗100 TCID50的 VSV的感染，经换算后比活性为1.1×105U/mg。这表明重组犬IFN-γ纯化蛋白具有较好的抗病毒活性。

2.6所表达犬IFN-γ在MDCK细胞上对H3N2亚型犬流感病毒的抑制作用

试验结果表明，与正常的MDCK细胞相比，纯化后的cIFN-γ在高剂量下对MDCK细胞无肉眼可见的细胞毒性(图7A和图7B)。对照组接种100 个 TCID50的H3N2亚型CIV后细胞病变明显，表现为皱缩、脱落、形成空斑等。高剂量组cIFN-γ对H3N2犬流感病毒具有抑制作用(图7B)，与H3N2亚型病毒感染后的MDCK细胞病变相比(图7D)，高剂量组细胞无明显的H3N2亚型病毒导致的细胞病变(图7B)，而低剂量组无法完全抑制H3N2增殖，出现明显细胞病变(图7C)。cIFN-γ在稀释26之后仍然能够抑制100 TCID50的H3N2亚型犬流感病毒产生细胞病变(表1)。

3　讨论

IFN是一种多功能的细胞因子，广泛应用于抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗细菌和寄生虫的治疗[13]，目前全球有 60 多个国家和地区应用人IFN制剂治疗约30多种病毒性疾病，犬病临床上已将重组IFN应用于防治狂犬病、犬细小病毒病、犬瘟热等病毒病[14]，但犬IFN-γ的研究并不多见。杨琪等[15]用pRc CMV2表达载体在鼠骨髓瘤细胞(SP20)中对犬IFN-γ进行表达，3组细胞系其培养上清均检测到抗VSV活性，活性平均达2 500 U/mL；陈忠广等[16]探讨了不同折叠促进剂、加样方式、温度、pH在稀释法复性条件下对重组犬γ干扰素体外折叠的复性影响，在4℃、pH8.0、精氨酸浓度0.5 mol/L，蛋白浓度0.15 mg/L及脉冲加样操作方式下，复性后重组犬IFN-γ的活性为1.35×104U/mL，比活性为3.74×106U/mg；张考等[7]构建含犬IFN-γ基因的重组腺病毒，能够介导cIFN-γ 在MDCK细胞中进行分泌表达，用含cIFN-γ基因的重组腺病毒处理MDCK细胞，可明显地抑制犬细小病毒在细胞中的增殖；韩阳等[8]应用SUMO表达系统高效稳定、可溶地表达了SUMO-cIFN-γ蛋白，cIFN-γ 对MDCK具有明显的抑制作用；王智权等[9]利用杆状病毒表达载体在家蚕5龄幼虫体内高效表达IFN-γ，Western blot 检测感染幼虫的血淋巴中有分子质量约19 ku的目的蛋白质条带，用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV-GFP 系统测定重组IFN-γ具有抗病毒活性，效价高于5×106U/mL；姜艳平等[10]依据乳酸菌密码子的偏好性和原核表达载体pAMJ399的特点，将原有的IFN-γ序列重新优化，构建了能分泌表达IFN-γ的重组乳酸乳球菌，培养上清液能抑制VSV 的复制，具有明显的抗病毒活性。

A.正常MDCK细胞；B：10-3倍稀释的犬IFN-γ处理MDCK后感染VSV；C.10-4倍稀释的犬IFN-γ处理MDCK后感染VSV；D.未经犬IFN-γ处理的MDCK感染VSVA.Normal MDCK cells;B.Cell morphology of MDCK infected with VSV after incubated with 10-3-fold Ca IFN-γ;C.Cell morphology of MDCK infected with VSV after incubated with 10-4-fold Ca IFN-γ;D.Cell morphology of MDCK infected with VSV without incubating with Ca IFN-γ

图6犬IFN-γ在MDCK细胞上的抗VSV活性测定

Fig.6Antivirus activity to VSV in MDCK cells induced by canine IFN-γ

A.正常的MDCK细胞；B.高剂量犬IFN-γ处理MDCK细胞后感染H3N2亚型病毒；C.低剂量犬IFN-γ处理MDCK细胞后感染H3N2亚型病毒；D.MDCK细胞感染H3N2 3 d后细胞病变A.Normal MDCK cells;B.Cell morphology of MDCK infected with H3N2 after incubated with high-does Ca IFN-γ;C.Cell morphology of MDCK infected with H3N2 after incubated with low-does Ca IFN-γ;D.Cell morphology of MDCK infected with H3N2 without incubating with Ca IFN-γ

图7　犬IFN-γ在MDCK细胞上对CIV H3N2亚型致病变的抑制作用

注：“-”CPE50阴性，“+”CPE50阳性。

Note:"-"CPE50negative，"+"CPE50positive.

以上研究可见，在不同表达系统中获得的基因工程IFN-γ均具备一定的生物活性，且真核系统表达的蛋白活性明显优于原核系统，但原核表达系统高效稳定、成本较低，在犬类病毒的治疗中更具优势。因此，本研究中选择能够高效表达蛋白且易于纯化的pET-32a原核表达载体，通过优化诱导表达的条件使蛋白在包涵体中获得了高效表达，表达的包涵体蛋白占菌体总蛋白的43.5%，通过镍柱纯化获得了较高纯度的蛋白，并在不同浓度脲梯度中透析，使包涵体蛋白复性后获得了良好的生物活性，复性后蛋白在MDCK细胞中对VSV的抗病毒活性为1.1×105U/mg。

另外，针对我国犬流感病毒感染日趋增多、临床治疗缺乏有效药物的状况，对原核表达的犬IFN-γ蛋白的抗流感病毒活性进行了鉴定,以CIV H3N2亚型病毒南京分离株为基础，检测了复性后cIFN-γ在MDCK细胞中的抗流感病毒增殖作用，结果显示原核表达系统获得的cIFN-γ在稀释28后已不能抑制100 TCID50的H3N2亚型病毒的致病变作用，说明原核表达的cIFN-γ 具备一定抗流感病毒作用，但活性不高，究其原因一方面是IFN-γ在机体内主要承担免疫调节的生物学功能，抗病毒效果低于IFN-α/β，另一方面可能与原核系统缺乏蛋白修饰加工系统，影响了蛋白的生物活性有关。但对流感病毒的治疗而言，这并不意味着原核表达的IFN-γ缺乏治疗效果，因为基因工程干扰素自身的结构特点，使其大量反复使用后极易产生抗干扰素抗体，因此单一种类的干扰素治疗效果并不理想，要提高干扰素治疗效果，除了通过提高干扰素活性来降低临床剂量之外，某些研究证实利用Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的协同增强作用[17-19]可以极大提高抗病毒效果，同时降低干扰素治疗剂量。在动物病毒方面，Yao等报道猪 IFN-α/β和IFN-γ在体外对伪狂犬病病毒具有协同抑制作用，Ⅰ型和Ⅱ型干扰素联合使用能够增强对口蹄疫病毒的抑制活性，鸡的IFN-α和IFN-γ也具有协同增强抑制病毒活性。但总体来看，目前IFN-γ体内抗病毒活性和IFN-α/IFN-γ联合用药研究并不完善，相关研究有待深入进行。

综上所述，本研究基于原核表达系统获得了能够稳定制备具有抗病毒活性的犬IFN-γ的方法，蛋白经变性、纯化/复性后对VSV具有较好的抗病毒活性，能够在MDCK细胞中对CIV H3N2亚型表现出抑制作用，为进一步研究CIV新型药物奠定了基础。

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收稿日期：2016-03-14

基金项目：公安部科技强警基础工作专项项目(2015GABJC32);公安部重点研究计划项目(2011ZDYJNJGQ011)

作者简介：秦海斌(1983-)，男，山东潍坊人，硕士，主要从事动物分子生物学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.21;S852.659.5

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0001-06

Prokaryotic Expression of Canine IFN-γ and Analysis of Its Antiviral Activities to Canine Influenza Virus A H3N2

QIN Hai-bin,ZHU Hai-juan,ZHU Qian,SONG Zhen-hua,WEN Hai,HE Xing-liang,GAO Yi-long

(NanjingPolicedogResearchInstituteofMPS,PolicedogTechnologyKeyLaboratoryofMPS,Nanjing,Jiangsu,210012,China)

Abstract:To prepare recombinant canine interferon gamma(IFN-γ) and study its antiviral effect to canine inflenza H3N2 ,the mature IFN-γ gene was amplied from template NDA extracted from healthy canine's serum lymphocytes which were induced by ConA. IFN-γ gene was insert into pET-32a to construct pET-c IFN-γ expression vector. pET-c IFN-γ was tansformed into E.coli BL21,in which fused protein can be expressed by IPTG inducing. The expression product was purefied and the antiviral activity to H3N2 was tested with MDCK-VSV method.Results showed that the fusion protein size was 34 ku and existed in form of inclusion bodies.After refolding and purification ,the recombinant protein still had high antiviral activity about 1.1×105 U/mg to VSV in MDCK. The dilution of 26 of IFN-γ could protect MDCK from the cytopathic effect caused by 100 TCID50of canine H3N2 virus.The results proved we successfully expressed the canine IFN-γ in prokaryotic system and laid a good foundation for the development of new drugs anti-canine influenza virus.

Key words:canine;interferon-γ;prokaryotic expression;Influenza virus