结直肠癌中Girdin和Akt1蛋白的表达及临床意义

许欣　姚冬颖



结直肠癌中Girdin和Akt1蛋白的表达及临床意义

许欣姚冬颖

目的检测Girdin和Akt1在结直肠癌中的表达情况，分析其与临床病理特征的关系。方法应用免疫组化EnVision两步法检测135例结直肠癌组织和40例正常结直肠组织中Girdin和Akt1蛋白的表达情况。结果Girdin和Akt1在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为38.5%和51.1%，均明显高于正常结直肠组织中的15.0%和20.0%(P<0.05)。Girdin和Akt1在结直肠癌组织中的表达与患者的年龄、性别比、肿瘤大小、组织分级无关(P>0.05)，而与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移情况密切相关(P<0.05)。Girdin和Akt1的表达在结直肠癌中呈正相关(P<0.05)。结论Girdin和Akt1可能参与结直肠癌的发生发展和转移，联合检测其表达情况有助于判断结直肠癌的恶性程度和预后。

结直肠肿瘤；Girdin；Akt1；免疫组化

目前，我国临床常见的消化道恶性肿瘤是结直肠癌，近几十年来人群发病率迅速上升，最新研究报道肠癌死亡率也呈逐年上升趋势并引起广泛关注，严重威胁人类健康生活，化疗作为癌症的主要治疗手段之一，减轻患者的症状，提高患者的生活质量，延长患者的寿命，是治疗的主要目的，提高患者的生活质量更具有切身好处。随着分子生物学的进展，寻找肿瘤标志物以及治疗靶点而变得尤为重要[1]。Girdin是新近发现的一种肌动蛋白结合蛋白，Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，二者均与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。本研究试图通过免疫组化染色的方法检测Girdin和Akt1在结直肠癌中的表达情况，进一步探讨其与临床病理特征的关系，为结直肠癌的诊断、预后判断和治疗方面提供客观的参考指标。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2014年1～12月河北省邢台市人民医院手术切除的石蜡存档的结直肠癌标本共135例，所有结直肠癌病例临床及病理资料均完整，术前均未接受任何放疗、化疗、内分泌抗肿瘤治疗等。从病理资料库获取临床参数资料，男73例，女62例；年龄29～73岁，中位年龄49岁；肿瘤直径<4 cm者54例，≥4 cm者81例；组织分级遵从WHO组织分级标准，其中高至中分化79例，低分化56例；癌组织未侵及浆膜层44例，癌组织侵及浆膜层91例；淋巴结无癌组织转移76例，淋巴结有癌组织转移59例。另外选取正常组织对照组40例，组织标本为取自距离癌组织边缘5 cm以上的正常结直肠组织。均常规取材组织标本，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2方法采用免疫组化EnVision两步法进行Girdin及 Akt1表达定位及半定量分析，全程免疫组化染色步骤严格按照试剂盒说明书进行操作，兔抗人Girdin多克隆抗体(稀释度1∶400)，购自于美国Santa Cruz公司，兔抗人Akt1多克隆抗体(工作液)及即用型免疫组化广谱试剂盒，均购于福州迈新生物技术开发有限公司。阴性对照用PBS代替一抗作，阳性对照为试剂公司提供的阳性切片。组织标本经连续切片、置烤箱烤干，常规二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱蜡至水，3%过氧化氢用蒸馏水新鲜配置，室温下处理阻断内源性过氧化物酶15 min，蒸馏水洗2 min，微波修复抗原10 min，滴加一抗，每张切片滴加50 μl，4℃湿盒过夜，次日PBS洗5 min,共3次，每张切片分别滴加二抗50 μl，孵育30 min在37℃恒温箱内，PBS洗切片，每次5 min共3次，滴加新鲜配置DAB显色剂，显微镜下控制染色，水充分冲洗以终止反应，苏木素复染、脱水、透明，中性树脂封片。

1.3结果判断 所有切片均观察5个高倍视野，其中每个高倍视野共计数200个肿瘤细胞。Girdin蛋白阳性产物主要定位于细胞核和(或)细胞质，采用半定量积分法，根据阳性细胞数和着色强度判断结果。阳性细胞所占百分比：0分为≤5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%；染色深度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，两者相乘：≤4分为阴性，>4分为阳性[2]。Akt1蛋白阳性产物主要定位于细胞质，阳性细胞所占百分比：0分为阴性，1分为1%～33%，2分为34%～66%，3分为>66%；染色深度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，两者相乘：<6分为阴性，≥6分为阳性[3]。以上切片判定的结果，全部由病理科两位高年资，且富有经验的医生在双盲情况下，认真观察评分确定。

1.4统计学分析应用SPSS 19.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关关系采用Spearman法分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Girdin和Akt1在结直肠癌和正常胃组织中的表达Girdin蛋白在结直肠癌组织中主要表达于癌细胞的细胞核，正常结直肠组织中仅少数微弱表达，135例结直肠癌中有52例表达，阳性表达率38.5%，明显高于在正常结直肠组织中的阳性表达率(15.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。Akt1蛋白在结直肠癌组织中主要表达于癌细胞的细胞质，正常结直肠组织中仅少数微弱表达于细胞膜，135例结直肠癌中有69例表达，阳性表达率51.1%，明显高于在正常结直肠组织中的阳性表达率(20.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2，表1、2。

图1　结直肠癌中Girdin(+)(EnVision法×200)

图2　在结直肠癌中Akt1(+)(EnVision法×200)

表1　结直肠癌和正常胃组织中Girdin和Akt1的表达　例(%)

2.2Girdin和Akt1在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系综合免疫组化染色实验结果与临床病理资料统计分析显示，Girdin蛋白的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移有关，淋巴结转移组Girdin的阳性率高于无转移组，Girdin蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织分级无明显相关性。Akt1蛋白的表达与生物学特性的关系与Girdin蛋白一致，也只与浸润深度、淋巴结转移有关，与患者的年龄、肿瘤大小、组织分级无明显相关性。见表2。

2.3Girdin和Akt1在结直肠癌中表达的相关性Spearman相关分析发现，135例结直肠癌中，Girdin和Akt1蛋白在结直肠癌中的表达呈正相关(r=0.287，P=0.001)。见表3。

表2　结直肠癌中Girdin和Akt1的表达与临床病理特性的关系　例

表3　结直肠癌中Girdin和Akt1表达的相关性　例

3　讨论

肿瘤的早期发现和治疗具有重要意义，随着对恶性肿瘤在分子水平上的研究越来越深入，多种新型肿瘤标记物的发现及分子靶向治疗，在肿瘤治疗方面的作用越来越重要。

Girdin蛋白定位于人类染色体2p16.1，由1870个氨基酸残基构成，相对分子质量220～250 kDa。Girdin通过参与细胞内信号传导、细胞骨架连接等途径，影响肿瘤细胞的侵袭转移等生物学行为。Girdin蛋白能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，血管新生和自我吞噬等的调节，最终导致肿瘤细胞的转移浸润[4,5]。已有报道，Girdin蛋白在多种恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用[6]。Shibata等[7]研究发现，由于Girdin 基因被沉默后，食道鳞癌细胞株KYSE其细胞运动性明显降低。免疫组化染色结果表明，在食道鳞癌患者中，Girdin 蛋白的表达在生存期明显较长患者的表达是明显低于生存期短暂的患者。进一步证明Girdin蛋白的表达与食道鳞癌细胞的侵袭性有明显相关性，Girdin蛋白可能是食道鳞状细胞癌预后和治疗的新的观察指标。国内丁耘峰等[8]研究发现，Girdin蛋白在正常乳腺组织和单纯导管上皮增生组织中的表达低于乳腺癌，且与肿瘤淋巴结转移情况以及TNM分期有关。本研究结果显示，在结直肠癌组织中，Girdin蛋白的阳性表达率显著高于正常黏膜组织，且随浸润深度的增加和淋巴结转移的发生而增高，说明其与结直肠癌浸润和转移过程有关，这与Jun等[9]的研究结果一致。提示Girdin蛋白高表达参与了肿瘤的形成和恶性演进过程，可以作为肿瘤生物学行为的判断指标。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其蛋白质产物与蛋白激酶A和C具有高度同源性，所以又称蛋白激酶B(protein kinase)。Akt基因3个亚型Akt1、Akt2、Akt3的功能研究发现，均参与下游底物活化，其中Akt2最为主要，Akt1、Akt2、Akt3三个亚型的结构同源，它们的功能也大部分相同，但是又各自具有不同的特征。Akt1在组织中分布广泛，也是PI3K/Akt信号转导通路下游的主要作用靶点，作为细胞信号网络中的关键分子，Akt1在结直肠癌的发生发展中，活化释放细胞存活信号，通过磷酸化激活，抑制其下游的多种作用底物，促进肿瘤细胞的生长、增殖、分化，抑制肿瘤细胞的凋亡。肿瘤细胞生长、转移的基本条件之一是血管的生成，P13K/Akt参与肿瘤血管生成的调控，促进肿瘤血管的生成，并促进恶性肿瘤细胞的侵袭与转移，增强肿瘤细胞对化学疗法以及放射疗法的抵抗性[10,11]。有研究发现Akt1基因在人胃癌中表达增加，并在胃癌的转移过程中发挥重要作用[12]，在肺癌中也发现Akt1异常表达和活性改变[13]。我们在研究中发现，Akt1蛋白的表达，在结直肠癌组织中的表达明显高于正常组织，并且其Akt1蛋白的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移，血管的侵犯以及临床病理分期等具有密切相关性，Akt1蛋白的表达在侵及浆膜层明显高于未侵及浆膜层的表达，Akt1蛋白的表达在有淋巴结转移的表达明显高于无淋巴结转移的表达。提示Akt1过度表达可能与结直肠恶性肿瘤的形成有关，且增强了癌细胞的侵袭和转移能力。

Girdin具有调控P13K-Akt信号传导通路的作用，研究中还发现与Akt信号通路的关系密切。Girdin是一个极其重要的靶蛋白，在PI3K/Akt信号传导通路的下游，Girdin也是一个络氨酸磷酸化蛋白，Girdin可以与Akt结合，并且磷酸化，并使其激活，继而进一步激活P13K-Akt通路，最终促进肿瘤细胞的迁移。与此同时，肿瘤细胞中Girdin蛋白的高表达，也可以显著增强Akt结构中的位点，包括Thr-308和Ser-473位点的磷酸化，从而Akt的活性被进一步增强，进而最终增强PI3K/Akt信号通路下游的靶蛋白的磷酸化。总之，Girdin蛋白在P13K-Akt信号传导通路中具有关键的调控作用[14,15]。我们研究发现，结直肠癌中Girdin与Akt蛋白的表达呈正相关关系，进一步证实了二者相

互作用促进了肿瘤的侵袭转移。

综上所述，在结直肠癌中Girdin和Akt1的蛋白表达均呈高表达，也呈正相关，并且越来越多的证据表明，Girdin和Akt1的蛋白异常是人类发生恶性肿瘤最常见的分子事件之一，它们可以作为生物标志物。Girdin和Akt1的蛋白活化促进肿瘤细胞的增生、转化、转移，且参与了结直肠癌的发生、发展以及肿瘤细胞的生长、侵袭等恶性生物学行为。开发Girdin和Akt1靶点的抗肿瘤药物，检测两者在肿瘤患者血液中的水平，作为一种预后评估，为早期发现恶性肿瘤，早期预防恶性肿瘤，以及对临床合理治疗恶性肿瘤也有重要意义，提供了一种新的方向和思路。

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Expression and clinical significance of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma

XUXin,YAODongying.

Desect1mentofPathology,XingtaiPeople’sHospital,Hebei,Xingtai054001,China

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma tissues,and to explore their correlation with clinicopathological features.MethodsThe expression levels of Girdin and Akt1protein were detected by immunohistochemistry (EnVision two-step method) in 135 cases of colorectal carcinoma tissues and 40 cases of normal colorectal tissues.ResultsThe positive expression rates of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma tissues were 38.5% and 51.1%,respectively, which were significantly higher than those (15.0% and 20.0%) in normal colorectal tissues (P<0.05). The expression levels of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma tissues were not correlated to patient's age, sex, tumor size and histolgical classification (P>0.05),however, which were closely related with the depth of infiltration and lymph node metastasis of colorectal carcinoma(P<0.05). Moreover the expression levels of of Girdin were positively correlated to those of Akt1 in colorectal carcinoma.ConclusionGirdin and Akt1 may be involved in the pathogenesis,development and metastasis of colorectal carcinoma. The combination detection of Girdin with Akt1 is helpful to evaluate the malignant degree and prognosis of colorectal carcinoma.

colorectal neoplasms;Girdin;Akt1;immunohistochemistry

2015-12-08)

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.15.005

054001河北省邢台市人民医院病理科

R 735.3

A

1002-7386(2016)15-2259-04