抑肽酶对白兔跟腱断裂模型修复过程的影响

白　杨　王　虎　单　臣

(吉林省人民医院，吉林　长春　130021)



抑肽酶对白兔跟腱断裂模型修复过程的影响

白杨王虎单臣

(吉林省人民医院，吉林长春130021)

目的观察抑肽酶对家兔跟腱断裂修复过程的影响。方法选用60只新西兰白兔，随机分为3组，每组6只。正常组不予任何处理；模型组和治疗组手术制作跟腱断裂模型，治疗组白兔在损伤周围部位注射抑肽酶，按10 000 kIU/ml注射1 ml，模型组每天注射等量生理盐水。于造模后第3天及第1、2、3、4周进行标本采集，观察跟腱断裂部位的病理形态及转化生长因子(TGF)-β1表达。结果抑肽酶治疗组术后纤维细胞增生较早(第3天可见)，炎性细胞少量浸润，后期(2～4 w)胶原纤维排列较规则、紧密、成熟，而模型组炎性细胞浸润时间长，胶原纤维排列不规则。TGF-β1表达量在术后第3天及第1周抑肽酶治疗组高于模型组，但第2～4周时抑肽酶治疗组中表达量明显减少且低于模型组。结论抑肽酶可通过调控TGF-β1的表达量，减轻炎症的反应，促进胶原细胞的增生，对跟腱断裂的修复有一定促进作用。

抑肽酶；跟腱断裂；转化生长因子-β1

跟腱断裂是骨科常见的一种疾病，因其供血较差，易导致组织营养不良、退行性变以及坏死等并发症，目前临床主要是是保守治疗及手术治疗，但都不能避免并发症的发生〔1，2〕。抑肽酶是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂。研究表明，抑肽酶对肝、脑、心等多种组织的缺血再灌注损伤有明显的保护作用〔3，4〕。但把抑肽酶应用于骨科的研究报道甚少。本研究旨在探讨局部注射抑肽酶的家兔跟腱断裂恢复情况及可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物来自吉林大学实验动物中心提供的新西兰白兔，同月龄、体重为(2.8±0.2)kg。所有实验动物在室温20℃～28℃，相对湿度40%～70%的动物房内饲养。

1.2模型制备造模前12 h开始禁食，不禁水，直至实验结束。将白兔固定于手术台上，实施跟腱局部麻醉后，用手术刀切断跟腱内侧1/2组织，使中央部分成“V”字缺损。跟腱周围被膜丝线连续缝合，丝线间断缝合皮肤。术后无菌纱布包扎伤口，并扎紧，防止脱落。每只家兔肌肉注射青霉素(1次/d，40万U/次)，连续3 d。伤口不给予更换纱布，不给予夹板固定，给予笼外放养，自由活动。

1.3分组及方法取60只新西兰白兔，随机分为3组，正常组(不做任何处理)，模型组，抑肽酶治疗组(制备模型缝合腱周膜后，损伤周围部位注射抑肽酶，按10 000 kIU/ml注射，缝合皮肤)。模型组和抑肽酶组家兔皮肤伤口处愈合良好，未见感染。各组动物均能存活至实验结束。

1.4病理观察于造模后第3天及第1、2、3、4周取样，将跟腱组织后置于10%甲醛溶液中固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，制成厚度为4 μm切片，进行HE染色，普通光学显微镜下观察跟腱组织的病理变化。

1.5免疫组织化学染色于造模后，观察跟腱断裂部位的病理形态及转化生长因子(TGF)-β1表达，注射抑肽酶后第3天及第1、2、3、4周处死白兔，进行标本采集。固定于10%甲醛，经石蜡包埋后，纵切厚4 μm标本，进行免疫组织化学检测。

2　结　果

2.1各组家兔跟腱病理组织结构的变化图1，图2可见，术后第3天，模型组断面可见大量炎性细胞浸润，纤维细胞较少，组织间水肿明显；术后第1周，炎性细胞仍多见，胶原纤维少，排列杂乱；术后第2周断面有肉芽组织形成，同时可见薄壁新生毛细血管生成；术后第3周炎性细胞少量浸润，成纤维细胞数量增多，但未成熟细胞较多，细胞呈圆形或软圆形部分；术后第4周，断面可见瘢痕形成，胶原纤维排列不规则，可见少量的炎性细胞。

抑肽酶治疗组术后第3天断面附近有一定量的炎性细胞，纤维细胞可见，组织水肿不明显；术后第1周，大量的成纤维细胞增生，胶原纤维多，炎性细胞少量浸润；术后第2周，胶原纤维排列较规则，术后第3周时胶原纤维排列紧密，且纵向生长呈条索状；术后第4周可见成熟呈梭型的纤维细胞，未见明显炎性细胞。

2.2TGF-β1在抑肽酶对家兔跟腱断裂模型跟腱修复中的表达TGF-β1在正常家兔跟腱有少量表达，而在模型组及抑肽酶治疗组可见大量表达，主要在断端组织中的炎性细胞、新生毛细血管内皮细胞、成纤维细胞中表达；术后第3天及第1周抑肽酶治疗组表达量高于模型组，但第2～4周时抑肽酶治疗组中表达量明显减少且低于模型组，见图3，图4。

图2　治疗组各时间点兔跟腱病理组织结构变化(HE，×200)

图3　正常组及模型组兔跟腱组织TGF-β1表达(DAB，×200)

图4　治疗组兔跟腱组织中TGF-β1的表达(DAB，×200)

3　讨　论

跟腱断裂是目前骨科学和运动医学面临的主要伤病之一。跟腱断裂后可以导致胶原基质和肌腱细胞的变化。组织病理学显示，胶原变性，胶原纤维紊乱和稀疏，血管和细胞增多，肌腱细胞梭形结构消失〔5〕。本研究说明成功地制造出家兔跟腱断裂模型。 抑肽酶是一种广谱非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂，因其有很强的血小板保护作用，能减少术后出血量和缩短创面渗血时间〔6〕；而且抑肽酶通过抑制炎症反应介质的释放，预防细胞因子级联反应，减少细胞黏附、聚集反应〔7〕，被广泛用于体外循环的心血管手术和多种疾病的治疗。近年来学者也尝试把抑肽酶应用于骨科疾病的治疗。靳启国〔8〕利用抑肽酶对各类蛋白酶均有不同程度的抑制作用，从而防止蛋白或肽类药物的降解而增加其利用度〔9〕，把与适量抑肽酶与Ⅱ型胶原一起灌服给关节炎模型大鼠，得到抑肽酶可以增强Ⅱ型胶原的治疗效果。但Brown等〔10〕报道在随机对照试验抑肽酶治疗26例跟腱腱病中，在治疗结果上没有发现明显的统计学差异，可能与其样本量不足，所得结果缺乏意义有关。 本研究提示把抑肽酶局部注射到血液供应较差的肌腱损伤处，可以减轻炎症的反应，促进胶原细胞的增生，对肌腱断裂的修复有一定促进作用。

TGF-β是一组具有多功能的蛋白质，在骨组织、血小板和软骨组织中含量丰富。目前人体内已经发现了 3种类型的TGF-β，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β的生理功能主要是促进细胞增殖、分化，促进细胞外基质分泌与合成，参与骨的重建等生理过程〔11〕。其中TGF-β1在近年来的实验研究证实对肌腱的形成、生长及修复过程起着重要的作用，在老鼠跟腱局部予TGF-β1治疗后可以提高Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维mRNA的表达〔12〕，用含有TGF-β1的多聚乳酸涂层的髓内针固定大鼠胫骨骨折后，骨折愈合时间明显缩短〔13〕。本实验结果进一步验证了TGF-β参与了跟腱愈合的整个过程。但在术后第3天至1 w时检测发现，抑肽酶组的TGF-β1高于模型组，这种现象说明抑肽酶可以通过改变TGF-β1的提前表达加速跟腱组织的愈合，而在术后第2～4周时检测发现，抑肽酶组的TGF-β1的表达量却低于模型组，这一结果可能和TGF-β1在预防跟腱粘连方面有关。文献报道，TGF-β1这种细胞因子的过度表达可以致瘢痕形成导致粘连，而适当的抑制TGF-β1表达，抑制胶原细胞的增生，减少胶原纤维的形成，从而抑制跟腱的外源性愈合机制，可以减少粘连的产生〔14〕。由此推测跟腱断裂术后注射抑肽酶，后期TGF-β1表达下降，是通过抑制了跟腱的外源性愈合机制，进而转化为依靠腱细胞自身的分化增殖的内源性愈合机制促进跟腱的愈合，减轻了粘连，使跟腱更趋于成熟。

1Maffuli N，Kader D.Tendinopathy of tendo achillis〔J〕.J Bone Joint Surg (Br)，2002；84(1)：1.

2Hess GW.Achilles tendon rupture：a review of etiology，population，anatomy，risk factors，and injury prevention〔J〕.Foot Ankle Spec，2010；3(1)：29-32.

3Vande Vusse LK，Zacharski LR，Dumas MG，etal.Prohemostatic therapy：the rise and fall of aprotinin〔J〕.Semin Thromb Hemost，2010；36(1)：103-12.

4Edmunds LH Jr.Managing fibrinolysis without aprotinin〔J〕.Ann Thorac Surg，2010；89(1)：324-31.

5Fritschy D，Wallensten R.Surgical treatment of patellar tendinitis〔J〕.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，1993；1(2)：131-3.

6Ozer Z，Sudu N，Dusmez D，etal.The effect of aprotinin on ischemia-reperfusion injury in the rabbit kidney〔J〕.Pharmacol Res，2001；44(6)：455-60.

7Landis RC，Asimakopoulos G，Poullis M，etal.The antithrombotic and anti inflammatory mechanisms of action of aprotinin〔J〕.Ann Thorac Surg，2001；72(6)：2169-75.

8靳启国.口服Ⅱ型胶原及抑肽酶对佐剂型关节炎大鼠治疗作用研究〔J〕.泰山医学院学报，2007；28(9)：677-80.

9Morishita M，Morishita I，Takayama K，etal.Hypoglycemic effect of novel oral microspheres of insulin with protease inhibitor in normal and diabetic rats〔J〕.Int J Pharm，1992；78(1)：9-16.

10Brown R，Orchard J，Kinchington M，etal.Aprotinin in the management of Achilles tendinopathy：a randomised controlled trial〔J〕.Br J Sports Med，2006；40(3)：275-9.

11Wildemann B，Schmidmaier G，Brenner N，etal.Quantification，ioealization，and expression of IGF-1 and TGF-beta 1 during growth factor stimulated fracture healing〔J〕.Galcif Tissue Int，2004；74(4)：388-97.

12Kashiwagi K，Mochizuki Y，Yasunaga Y，etal.Effects of transforming growth factor-β1 on the early stages of healing of the achilles tendon in a rat model〔J〕.J Plast Reconstr Surg Hand Surg，2004；38(2)：193-7.

13Schmidmaier G，Wildemann B，Ostapowicz D，etal.Long-term effects of local growth factor(IGF-1 and TGF-beta 1)treatment on fracture healing.A safety study for using growth factors〔J〕.J Orthop Res，2004；22(3)：514-9.

14Chang J，Thunder R，Most D，etal.Studies in flexor tendon wound healing：neutralizing antibody to TGF-bl increases postoperative range of motion〔J〕.Plast Reconstr Surg，2000；105(1)：148-55.

〔2015-12-25修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.008

吉林省自然科学基金项目(201215199)

单臣(1968-)，男，主任医师，主要从事周围神经及软组织损伤的研究。

白杨(1971-)，女，主管护师，主要从事护理及心理康复教育研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3368-03；