黄芪注射液加强心肌保护液在兔未成熟心肌保护作用的研究

张　霄，李志英



黄芪注射液加强心肌保护液在兔未成熟心肌保护作用的研究

张霄1，李志英2

1. 山西医科大学(太原 030001)；2. 山西医科大学第一医院

摘要：目的探讨黄芪注射液加强心肌保护液对未成熟兔心肌的保护作用。方法24只幼兔(兔龄14 d～21 d)随机分3组，每组8只。用Langendorff模型灌注离体心脏。平稳灌注45 min后，主动脉根部灌注STH液(4℃)。对照组(Con)：灌注STH液；黄芪组(AS)：黄芪注射液+STH灌注；5-羟葵酸液(5-HD)组：5-HD+STH灌注。3组心脏均经历停灌30 min(保温、保湿)及再灌注40 min复制模型。观察3组的血流动力学、心肌酶、冠脉流出液、病理学变化、心肌能量变化及分子生物学改变。结果黄芪组左心功能、冠脉流量恢复及再灌后心肌组织内ATP含量明显优于对照组及5-HD组，心肌酶值明显低于对照组及5-HD组，心肌细胞线粒体超微结构分析显示预处理组线粒体损伤轻于对照组及5-HD组，心肌诱导型一氧化氮合酶(iNOS)AS组78.4 ng，高于对照组20.8 ng及5-HD组61.8 ng。结论黄芪加强心肌保护液对兔未成熟心肌有保护作用，黄芪可能是KATP通道开放剂。

关键词：黄芪注射液； 心肌保护液； 未成熟兔心肌；5-羟葵酸； KATP通道

黄芪为豆科多年生草本植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge Var Mongholicus (Bge) Hsiao 或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch) Bge的干燥根。药性甘，微温、归脾、肺经。功效为生阳补气，固表益卫，消肿利水，托疮生肌。目前在临床上已广泛应用且取得了很好的疗效。本实验探讨黄芪注射液加强心肌保护液对未成熟兔心肌的保护作用，及是否对ATP依赖钾离子通道(KATP)通道有作用，并从机制上加以讨论。

1材料与方法

1.1实验仪器与试剂多导生理记录仪(Macintosh，Quadra 610，Japan；Chart 3.6v/s)，恒温循环器(HX-10555，北京)，改良Langendorff 装置，Stocker血泵(Gemany)，混合气(O2∶CO2=95%∶5%，北京)，超纯水(SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海)。Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液成分：NaCl 118.5、NaHCO325.0、KH2PO41.2、KCl 4.8、MgSO4·7H2O 1.2、CaCl2·2H2O 1.8、葡萄糖 11.0。pH 7.4±0.5。黄芪注射液为成都地奥公司生产，每毫升含原生药2 g。5-羟葵酸(5-hydroxydecanoic acid， 5-HD)编号H135，美国sigma公司。

1.2实验模型建立实验兔为中国医学科学院协和医科大学实验动物中心提供(纯种新西兰白兔)。兔重300 g～350 g，兔龄14 d～21 d。氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.5 g/kg)，经股静脉肝素化(150 IU/kg)，剑下开腹腔，沿前胸壁充分游离膈肌，双侧横断肋骨，胸腔完全暴露，迅速剪开壁层心包，小心快速取出心脏，浸入4℃K-H缓冲液(KHB)，主动脉略修剪， 30 s内连于Langendorff灌注装置并用39℃经混合气(O2∶CO2=95%∶5%)平衡的K-H缓冲液灌注，在肺动脉根部剪开以保证冠脉回流通畅，灌注压60 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kpa)。剪开左心耳，向左室插入与多导生理检测仪相连的带球囊导管，立即将心脏移入保温(39℃)缸内。

1.3实验分组及步骤平稳灌注30 min后，向球囊内缓慢注入生理盐水，调整至左室舒张压(LVDP)为10 mmHg(1 mmHg=0.133 kpa)。将18只幼兔随机分为3组。主动脉根部灌注对照组(CON)：灌注STH液；黄芪组(AS)：AS(2 mL/kg)+STH液灌注；5-HD组：5-HD(100 μmol/L)+STH灌注。3组心脏均经历停灌30 min(保湿、保温)、再灌注45 min。

1.4测定指标平稳灌注30 min时，记录冠脉流量(CF)、心率(HR)、LVDP、左室压力上升和下降最大速率(±dp/dtmax)作为基础值。全程记录再灌注后左室波动图形；分别记录再灌后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min的CF、HR、LVDP、±dp/dtmax测定值，并把它们表达为其对基础值的恢复率。取再灌注后10 min冠脉流出液，以自动生化分析仪(日立，T170A型)测定肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)。再灌注毕，快速取下心脏，滤纸吸尽心脏表面水分，剪取心尖部位约200 mg组织液氮保存，用以测定ATP。每组随机取一例左室心肌作电镜及用分子生物学方法测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。

2结果

2.1血流动力学变化平衡期末，3组各项血流动力学指标无统计学意义。再灌后，黄芪组LVDP、±dp/dtmax在多个时间点上的恢复率均较对照组及5-HD组显著性增高(P<0.05)。加入5-HD后其保护作用减弱，甚至消失。详见表1。

表1　各组STH灌注后血流动力学恢复情况比较(±s) 　%

2.2心肌酶缺血复灌5 min后心肌酶值以AS组最低，对照组及5-HD组复灌后心肌酶值明显升高。详见表2。

IU/L

2.3心肌组织内ATP含量AS组心肌组织内ATP含量明显较对照组及5-HD组高。AS组(35.93±7.83)μg/(g· wet)，与CON组比较有统计学意义(P<0.01)；5-HD组(22.34±2.79)μg/(g·wet)，与CON组比较无统计学意义(P>0.05)；对照组为(15.55±1.98)μg/(g·wet)。

2.4形态学改变透射电镜观察显示：对照组心肌结构尚清。部分线粒体空泡变性，肿胀；部分心肌肌原纤维排列较散乱，肌节长度不一，有灶状肌丝溶解破坏；部分线粒体内出现致密沉积物，肌质网扩张。黄芪预处理组：心肌结构清楚；肌原纤维排列整齐；肌节结构较清晰，部分肌节缩短，H带结构不清，少数区域肌纤维肌节有破坏，Z线模糊；线粒体数量相对较少，个别区域轻度空泡变性；肌质网轻度扩张；未见糖原蓄积。总体印象：黄芪组心肌损伤较对照组减轻。5-HD组介于以上两组之间。

2.5iNOS改变用PCR法测定相对含量为：AS组78.4 ng；5-HD组61.8 ng；对照组20.8 ng。

3讨论

黄芪为传统中药，黄芪注射液临床用于冠心病、心绞痛、窦缓等的治疗疗效显著。黄芪对心肌的缺血再灌注损伤有保护作用，能降低心率、缩小心肌缺血范围，维持内皮细胞自稳态，显著改善心肌缺血再灌注时左室的舒张及收缩功能，还具有清除氧自由基和抗脂质过氧化、减轻钙超载、减轻白细胞聚集等作用。

黄芪预处理对未成熟心肌有保护作用[1]，其保护作用是通过启动内源性保护机制来完成的。黄芪是ATP依赖钾离子通道的开放剂[2]。开放细胞膜KATP通道能缩短心肌细胞的动作电位，并由此引发保护效应。位于线粒体内膜的KATP通道在预处理过程中也发挥着重要的作用。5-羟葵酸是线粒体KATP通道的特异性阻断剂。将黄芪加入St.ThomasⅡ号心肌保护液中，了解线粒体KATP通道能否开放，是否同样能增强心肌保护液对未成熟兔心肌的保护作用。结果显示，AS组无论在左心收缩舒张功能、心率、冠脉流量的恢复，还是在减少再灌后心肌酶值等方面均较单纯应用心肌保护液组及5-HD组好。AS组的组织ATP含量较对照组及5-HD组明显提高。电镜观察AS组心肌损伤较对照组及5-HD组减轻，分子生物学方法测定iNOS半定量，AS组明显高于对照组及5-HD组。

线粒体不仅是细胞能量的供应站，并且具有很强的缓冲心肌细胞胞浆内Ca2+的能力。线粒体内膜内负外正的电位差是线粒体吸收Ca2+的主要动力。线粒体KATP通道在缺血过程中开放对心肌产生保护的机制可能与该通道开放后K+内流使线粒体内膜电位发生去极化有关；线粒体内膜电位绝对值降低，减小了Ca2+进入线粒体基质的动力，防止了线粒体钙超载的发生。目前越来越多的实验发现伴随着缺血再灌注损伤是线粒体的钙超载而不是细胞浆内的钙超载。同时，随着K+内流，线粒体内渗透压升高，胞浆水分进入线粒体内引起线粒体基质膨胀；研究表明线粒体体积适度(10%以内)的增加能激活脂肪酸氧化和电子转移，促进ATP的生成。此外，线粒体KATP通道开放还能减少线粒体内氧自由基的生成。

黄芪对未成熟兔心肌有保护作用的机制为黄芪可以激发未成熟兔心肌细胞启动内源性保护：①腺苷生成增加：停跳液中加入黄芪注射液，可使缺血后心肌组织的内源性腺苷释放明显增加，实现腺苷多方面的心肌保护作用[3-4]。②NO浓度增加：心肌细胞缺血早期，当细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)/环磷酸腺苷(cAMP)比值下降时，可刺激心肌细胞和内皮细胞产生缓激肽，进而作用于内皮细胞的缓激肽B2受体产生NO，缓激肽和NO均有保护心肌作用；iNOS的激活可能参与预处理的延迟保护(DP)作用。NO与缺血再灌注损伤有密切关系，其作用机制可能是通过阻碍中性粒细胞的黏附而减轻缺血再灌注损伤程度[5]。黄芪可以提高再灌注后未成熟兔心肌iNOS的含量。③开放ATP依赖钾离子通道。对KATP通道作用机制可能为：KATP通道对K+具有高度选择性，具有时间和电压不依赖性，开放和关闭状态只受ATP浓度的控制。本实验显示黄芪可以明显提高心肌组织ATP含量，而5-HD组ATP含量则明显减少，即5-HD阻断了KATP通道，减弱了黄芪的作用，甚至消失；进而证实黄芪对未成熟心肌的保护可能是通过开放KATP通道而实现的。研究发现缺血再灌注损伤是线粒体的钙超载而非细胞浆内的钙超载[6]，K+内流使线粒体内膜电位发生去极化，线粒体内膜电位绝对值降低，减小了Ca2+进入线粒体基质的动力，防止了线粒体钙超载的发生；线粒体体积适度增加(10%以内)，会促进ATP的生成[7]。随着K+内流，线粒体内渗透压升高，胞浆水分进入线粒体内引起线粒体基质膨胀，ATP生成增多[8-10]。黄芪可能是通过开放线粒体膜KATP通道、K+内流使线粒体内膜电位发生去极化，阻止Ca2+进入线粒体基质，防止线粒体钙超载，同时使线粒体体积适度增加，ATP的生成增多而起到保护未成熟兔心肌的作用。

黄芪加强停跳液通过增强线粒体KATP通道的开放对未成熟兔心肌有保护作用，但对其机制仍不十分清楚，须进一步深入研究。

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(本文编辑王雅洁)

通讯作者：李志英，E-mail：leezhiyingcpb@sina.com

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.016

文章编号：1672-1349(2016)13-1491-03

(收稿日期：2016-05-25)