远志总皂苷对癫痫模型大鼠NMDA 受体表达的影响

2016-08-11李新毅

中西医结合心脑血管病杂志 2016年13期

李　艳，景　玮，马　彪，李新毅

李艳1，景玮1，马彪2，李新毅1

1.山西医科大学附属山西大医院(太原 030001)；2.山西省晋中市第一人民医院

摘要：目的观察远志总皂苷(Tenuigenin，TEN)对癫痫模型大鼠N-甲基-D天门冬氨酸(NMDA)受体表达的影响，探讨TEN对癫痫继发认知障碍干预作用的机制。方法32只雄性Wistar大鼠，随机分为对照组(8只)、模型组(12只)、远志总皂苷防治组(12只)。采用腹腔注射戊四氮(PTZ)溶液制作癫痫大鼠模型，远志总皂苷防治组在腹腔注射戊四氮的同时给予灌服远志总皂苷，对照组分别注射及灌服等剂量的生理盐水。采用免疫组化方法检测大鼠海马CA1区NMDA受体表达。结果模型组大鼠海马CA1区NMDA受体平均灰度值显著高于对照组，远志总皂苷防治组大鼠海马CA1区NMDA受体平均灰度值显著低于模型组。结论远志总皂苷可显著提高癫痫模型大鼠海马CA1区NMDA受体表达，这可能是其减轻癫痫继发认知障碍的部分机制。

关键词：癫痫；远志总皂苷；海马；NMDA受体

癫痫是由脑部神经元高度同步异常放电而引起的脑功能障碍综合征。目前，全世界有1%的人口受到此病的困扰，而我国癫痫患病率更是高达7%[1]。值得关注的是，30%～40%癫痫病人伴有不同程度的认知功能受损[2]，成为影响病人生活质量的一个重要因素。远志是我国传统的安神益智良药，远志的成分复杂，而其中的总皂苷是改善认知的重要成分。有研究证明，远志总皂苷(Tenuigenin，TEN)可以在多个阶段影响小鼠的学习记忆能力，关于远志总皂苷对学习记忆影响的胆碱能机制已有部分研究，但其对癫痫后N-甲基-D天门冬氨酸(NMDA)受体表达影响的研究尚不多见[3]。本实验采用腹腔注射PTZ溶液制作癫痫大鼠模型，通过免疫组化方法观察大鼠海马CA1区NMDA受体表达变化及远志总皂苷对其影响，探讨TEN改善学习记忆功能的机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物32只雄性Wistar大鼠，体重为200 g～250 g，由北京海淀兴旺动物养殖场提供，室温(25.5±2)℃喂养。

1.1.2药品、试剂及实验仪器远志总皂苷，纯度为72%，在山西大学中医药现代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸馏水中，充分溶解后置于4℃环境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)购于Sigma公司，将其溶于生理盐水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃环境保存；脑立体定位仪购于深圳瑞沃德公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及造模将32只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、远志总皂苷防治组(375 mg/kg)，对照组8只，模型组与远志总皂苷防治组各12只。模型组给予腹腔注射致惊厥剂量的PTZ(40 mg/kg)，注射时间为每日08：00～09：00，注射完观察大鼠2 h，注意记录发作次数和分级，每隔1 d称大鼠体重进行剂量调节，连续给药28 d，停药7 d，再以相同剂量点燃，以连续2次以上、4级以上发作视为造模成功，惊厥发作以Racine法分级标准进行判断。远志总皂苷防治组在腹腔注射戊四氮的同时灌服远志总皂苷溶液(375 mg/kg)，给药35 d，然后腹腔注射戊四氮点燃。对照组则给予生理盐水灌胃及腹腔注射。

造模结果：对照组8只大鼠均存活，模型组大鼠由于癫痫发作死亡3只，未达点燃标准的1只，造模成功8只，远志总皂苷防治组大鼠癫痫发作死亡2只，未达点燃标准的1只，造模成功9只。

1.2.2切片制备经以上处理后，大鼠经7%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉，开胸腹充分暴露心脏和肝脏，剪开左侧心尖部，将导管插入左心室并固定，同时剪开右心耳。快速灌注生理盐水250 mL 左右至肝脏完全变白，待右心室流出澄清液体后，用40 mol/L 多聚甲醛固定液先快速再缓慢灌注100 mL左右至大鼠肝脏变硬，肢体僵直后断头，完整取出鼠脑并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定4～6 h，脱水，透明，石蜡包埋。冠状位连续海马切片，切片厚度为4 μm。

1.2.3免疫组化染色采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫组化染色法，具体步骤如下：①石蜡切片常规脱蜡；②PBS洗2 min×2 次，3% 的过氧化氢溶液滴至切片，室温10 min，灭活内源性酶；③PBS洗2 min×2 次，0.1% 胰酶修复；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封闭液，室温30 min，甩去多余液体，不洗；⑤滴加稀释的兔抗大鼠NMDAR2B(1∶30)，4 ℃ 过夜；⑥ 复温40 min，PBS 冲洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS 洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 显色，镜下控制染色程度，7 min～8 min后蒸馏水终止显色反应；⑩苏木素轻度复染11 s。脱水，封片。光镜下观察。

1.2.4阴性对照的建立以10% PBS 代替一抗进行免疫组化染色，其余步骤如前。1.2.5灰度值测定采用BI2000医学图像分析系统，400倍物镜下，在相对应的海马CA1区内，随机各取5个视野，测单个视野中NMDA受体的灰度值。

2结果

各组海马CA1区NMDA受体(见图1)，免疫染色阳性物质主要存在于神经元细胞表面。其中对照组免疫染色阳性细胞排列规则，细胞免疫染色深；模型组NMDA免疫染色阳性细胞排列欠规则，染色较淡，其平均灰度值显著大于对照组(P<0.05)；远志总皂苷防治组免疫染色阳性细胞排列较模型组规则，染色较深，其平均灰度值显著小于模型组(P<0.05)。详见表1。

图1　各组海马CAI区NMDA受体

组别nNMDA受体灰度值对照组8186.87±1.46 模型组8205.99±2.531)远志总皂苷组9195.35±2.332) 与对照组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.05。

3讨论

NMDA 受体在短暂记忆、空间记忆以及被动回避记忆中均有重要的作用[4]。长时程增强(LTP)是一种突触可塑性的形式，是学习和记忆的细胞基础[5]。神经电生理学研究表明[6]，大脑海马LTP 是记忆形成和巩固过程中神经元活动的客观指标。海马发育早期，谷氨酸能神经元内的NMDA 受体参与了LTP的建立，一定强度和频率的电刺激，可使谷氨酸能突触的后膜去极化，移除阻碍Ca2+内流的Mg2+，使NMDA 受体通道复合体的Ca2+通道开放，Ca2+内流并触发神经元内一系列生化反应，最终改变突触后膜的性质，建立LTP。

癫痫与认知功能损害的关系已引起广泛重视，癫痫发作次数越频繁，持续时间越长，导致的损害就越大[7]。癫痫的发生、发展与脑内神经递质失衡有关，谷氨酸是大脑中含量最高的兴奋性神经递质之一，而N-甲基-D-天门冬氨酸受体是一种重要的离子型谷氨酸受体，它在突触传递和神经可塑性等生理过程中扮演了关键角色，而突触可塑性是学习记忆的基础，因此研究癫痫后NMDA受体表达的变化对阐明其认知障碍发生的机制具有重要的意义[8]。

作为益智安神药远志在临床上的应用已有千年的历史，远志总皂苷作为其主要成分[9]，对学习记忆影响的研究也日益受到重视[10]。

本实验结果显示模型组大鼠海马CA1区NMDA受体平均灰度值显著高于对照组(P<0.05)，远志防治组大鼠海马CA1区NMDA受体平均灰度值显著低于模型组(P<0.05)。结果表明，癫痫模型组大鼠海马CA1区NMDA受体表达下降，而远志总皂苷可显著提高Ep模型大鼠海马CA1区NMDA 受体的表达。

远志总皂苷可能通过对癫痫后NMDA受体表达的影响减轻对海马LTP的抑制，进而改善癫痫后的认知障碍。

参考文献：

[1]Binder DK，Steinhauser C.Role of astrocyte dysfunction in epilepsy encyclopedia of basic epilepsy research[M].Academic Press，Oxford， 2009：412-417.

[2]Fisher RS，van Emde Boas W，Blume W，et al.Epileptic seizures and epilepsy：definitions proposed by the International League Against Epilepsy(ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)[J].Epilepsia，2005，46：470-472.

[3]陈勤，高晨曦，葛礼浩，等.远志皂苷对脑定位注射Aβ1-40拟AD大鼠脑内神经形态病理学变化的影响[J].激光生物学报，2006，15(3)：294-298.

[4]焦聚，马融，任献青.NMDA受体及其与癫痫所致认知功能损害的关系[J].中国中西医结合儿科学，2014(3)：215-218.

[5]柯珂，乔琰，王俊.NMDA 受体概述及其在学习记忆中的作用[J].广西科学院学报，2011，27(1)：49- 54.

[6]Durand GM，Kovalchuk Y，Konnerth A.Long-term potentiation and functional synapse induction in developing hippocampus[J].Nature，1996，381：71-75.

[7]Thompson PJ，Duncan JS.Cognitive decline in severe intractable epilepsy[J] .Epilepsia，2005，46(11)：1780-1787.

[8]唐玲，唐荣伟，唐晶，等.突触可塑性与学习记忆关系的研究进展[J].川北医学院学报，2012(1)：89-92.

[9]马彪.远志总皂苷对癫痫模型大鼠认知功能障碍的影响及其突触机制[D].太原：山西医科大学，2015.

[10]李晓峰，赵大鹏，陈树沙，等.远志总皂苷对AD模型大鼠海马nACHRα4亚基及PSD-95表达的影响[J].神经药理学报，2011，1(3)：16-22.

(本文编辑王雅洁)

基金项目：山西省青年科技研究基金(No.2013021036-1)，课题名称：癫痫模型大鼠认知功能障碍突触机制探讨及远志总皂苷对其影响

通讯作者：李新毅，E-mail：876379752@qq.com

中图分类号：R285.5