镉累积效应对土壤微生物活性的影响

罗园园，吴雪楠，刘文娟，柴汉魁，姚　俊

(北京科技大学土木与环境工程学院，北京 100083)



镉累积效应对土壤微生物活性的影响

罗园园，吴雪楠，刘文娟，柴汉魁，姚俊

(北京科技大学土木与环境工程学院，北京 100083)

摘要：重金属累积效应是目前重金属污染土壤的主要形式，研究重金属多次污染对土壤微生物活性的影响是急需解决的科学问题。研究了外源镉的累积效应对土壤FDA水解酶活性和微生物能量代谢活性的影响。结果表明，在镉总量相同时，随着镉加入次数的增多，低浓度(2.0 mg·kg-1)镉对FDA水解酶活性的促进作用变大，高浓度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)镉的抑制作用变小，微生物生长速率常数k变大；镉以少量多次的方式加入土壤，微生物受到反复刺激后生长速率变快，FDA水解酶活性升高。

关键词：镉；累积效应；土壤微生物；FDA水解酶；能量代谢

土壤是支撑生产活动、调节营养流动、维持陆地生态系统良好运转的主要场所[1]，其中土壤微生物发挥着重要作用。但人类活动如采矿、冶炼、化石燃料燃烧、施肥等使大量农田土壤受到重金属污染[2]。土壤中重金属累积会影响土壤微生物活性[3]。镉被认为是环境中毒害最大的痕量重金属元素之一[4]，也因其对土壤微生物的显著毒性效应成为目前研究最多的重金属之一。

土壤酶是土壤中十分活跃的有机组分[5]，对土壤中的多种生物化学反应过程起调控作用[6]，是土壤微生物代谢过程的主要媒介[7]。土壤酶的种类有很多，FDA水解酶是其中一种，能够简单准确地反映土壤总体微生物活性[8]，可用作短期评估土壤微生物变化的有效工具[9]。微量热法是近年发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法[10]。研究发现，微量热法和土壤呼吸强度、土壤微生物生物量、微生物数量及土壤酶活性有很高的相关性[11]，可作为评价土壤微生物活性的有效手段。

目前，关于添加外源重金属对土壤微生物活性影响的研究较多，多数停留在一次加入重金属后测定土壤微生物活性变化情况。但实际环境中重金属不是一次进入环境中，而是逐步、连续、多次被排放到环境，在此期间土壤微生物会经历一个反复受重金属刺激的过程，活性发生变化。Tortella等[12]研究发现，重复向土壤施加有害物质造成的影响或许与一次加入有所不同。李晶等[13]通过比较土壤微生物对一次干扰和二次干扰的不同响应来研究土壤生态系统功能稳定性。Tobor-Kaplon等[14]通过测定细菌生长速率和土壤呼吸情况验证了剧烈扰动过的系统再次经受外界胁迫的能力会明显下降的假说，但Philippot等[15]却指出，第一次干扰反而增加了微生物对抗二次干扰的能力。多项研究结果表明，多次向土壤施加污染物质会影响土壤微生物活性和微生物群落结构[16-20]。

作者研究了镉浓度对土壤微生物活性的影响及相同浓度镉以不同添加次数进入土壤后对FDA水解酶、微生物能量代谢的影响，探究镉累积效应对土壤微生物活性的较长期影响，拟为研究镉对土壤环境的影响提供参考。

1实验

1.1土样

土样采自北京科技大学校园。采样深度为0～20 cm，去除表层被草根和颗粒覆盖的土壤，风干后过100目筛，保存于4 ℃冰箱中备用。土样的理化性质：pH=7.57，有机质0.73%，速效磷60.0 mg·kg-1，速效钾120 mg·kg-1，全氮65.0 mg·kg-1。

1.2试剂与仪器

氯化镉，分析纯，天津光复科技发展有限公司。

UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；TAMⅢ型十二通道微量量热仪，美国TA仪器公司。

1.3方法

取土样培养于塑料杯中，每份40 g，向其中加入镉，使土样中镉浓度分别为2.0 mg·kg-1、20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1。镉加入方式分3种：(1)第1 d一次性加入；(2)第1 d、3 d将镉分2次加入，每次加入总剂量的1/2；(3)第1 d、3 d、5 d将镉分3次加入，每次加入总剂量的1/3。设置空白对照组。共10份土样，置于37 ℃恒温培养箱培养，控制含水率在12%左右。分别在第1 d、7 d、14 d、21 d、28 d测定土样的FDA水解酶活性，并取第28 d的土样测定微生物能量代谢活性。

1.4测定方法

1.4.1FDA水解酶活性测定

采用荧光素比色法[5]。每次测定重复3次。

1.4.2微生物能量代谢活性测定

取1 g土样于4 mL安瓿瓶中，加入200 μL含有5 mg葡萄糖和5 mg硫酸铵的营养液，将安瓿瓶置于微量量热仪中，记录土壤微生物的热功率-时间曲线。

2结果与讨论

2.1镉对FDA水解酶活性的影响

2.1.1镉浓度与培养时间对FDA水解酶活性的影响(图1)

图1　镉浓度与培养时间对FDA水解酶活性的影响Fig.1　Effects of Cd concentration and culture time on FDA hydrolase activity

从图1可以看出，在14 d内，低浓度(2.0 mg·kg-1)镉对FDA水解酶活性有促进作用；随培养时间的延长，高浓度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)镉对FDA水解酶活性起先促进后抑制的作用。这与重金属和酶的结合机理有关[21],重金属与酶的结合随时间变化导致了酶活性也随时间而改变。

2.1.2镉累积效应对FDA水解酶活性的影响(图2)

从图2可以看出，浓度为2.0 mg·kg-1的镉分批加入土壤中，第7 d、14 d、28 d时，随着加入次数的增多，对FDA水解酶活性的促进作用增大，且分3次加入的FDA水解酶活性最高；浓度为20.0 mg·kg-1的镉分批加入土壤中，第14 d时，随着加入次数的增多，对FDA水解酶的抑制作用变小，分3次加入的FDA水解酶活性最高；浓度为40.0 mg·kg-1的镉在第14 d、21 d、28 d对FDA水解酶抑制作用也是随加入次数的增多而变小。表明，FDA水解酶活性与镉每次加入量有关。总量一定时，镉每次加入量与累积加入次数成反比，低浓度镉对FDA水解酶活性有促进作用。镉进入土壤后会影响土壤微生物生物量，土壤微生物生物量与重金属量呈负相关关系[22]，土壤酶活性与土壤微生物生物量呈正相关关系[23]。因此，随着加入次数的增多，镉每次加入量越少，FDA水解酶活性越高。这与Li等[7]研究发现FDA水解酶活性与土壤中镉总量呈负相关关系的结果吻合。

图2镉累积效应对FDA水解酶活性的影响

Fig.2Influence of Cd cumulative effect on FDA hydrolase activity

FDA水解酶活性与土壤受镉干扰的频次有关。某些微生物对外源镉的累积加入产生一定的耐受性，累积增多，土壤中微生物抗干扰能力增强，即一次干扰增强了微生物应对二次干扰的能力，导致酶活性较高。相关研究也验证了这一点，Burges等[24]通过向土样中分3次加入等量镉发现，葡萄糖苷酶活性随加入次数的增多而升高，第2次加入镉后真菌基因数量较第一次加入后减少，但第3次加入后数量增多，推测原因为土壤中的真菌对镉进入土壤的频次较敏感，土壤酶活性和生物量与重金属侵染的频次有关。Heuer等[25]向土壤中分3次加入含有磺胺嘧啶的肥料，研究表明，土壤中含抗性基因的微生物反复受到磺胺嘧啶的刺激后累积增多。本研究中，总量相同的镉进入土壤后，加入次数增多，一些微生物受到刺激后生长较快，累积增多，引起酶活性升高。

镉浓度为2.0 mg·kg-1时第21 d、镉浓度为20.0 mg·kg-1时第7 d、21 d、28 d及镉浓度为40.0 mg·kg-1时第7 d的FDA水解酶活性并未严格呈现出随加入次数的增多而升高的趋势，可能是因为，微生物群落受到重金属反复刺激后会发生不稳定变化。Ding等[26]研究发现，向土壤中分3次加入磺胺嘧啶较一次加入时土壤中微生物群落的不稳定性提高，弹性降低。也可能是由于浓度接近的镉对FDA水解酶活性的影响很小而造成的误差。但镉分次加入均比一次加入对FDA水解酶活性的促进作用大、抑制作用小。

2.2镉对土壤微生物代谢活性的影响

2.2.1镉浓度与培养时间对土壤微生物微量热曲线的影响(图3)

图3　镉浓度与培养时间对土壤微生物微量热曲线的影响Fig.3　Effects of Cd concentration and culture time on microcalorimetric curves of soil microbacteria

由图3中峰高(最大热功率Pmax)、出峰时间(最大热功率时间tmax)可知，低浓度(2.0 mg·kg-1)镉对微生物能量代谢有促进作用，高浓度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)镉有抑制作用。

2.2.2镉累积效应对土壤微生物微量热曲线的影响(图4)

由图4可以看出，总量相同的镉分次加入土壤后对土壤微生物能量代谢活性的影响是不同的。

2.3镉累积效应对生长速率常数的影响

生长速率常数(k)是反映微生物化学应力和微生物呼吸的重要参数[27]，可通过对微量热曲线中对数期部分的lnPt和t的数据按式(1)计算得到(表1)。

lnPt=lnP0+kt

(1)

式中：t是对数期的某一时刻；P0是微生物所有细胞进入对数期时的初始总放热功率；Pt是t时刻的总放热功率。

由表1可知，(1)Pmax与加入次数未呈现较好的相关关系。低浓度(2.0 mg·kg-1)镉影响下的土壤Pmax随着镉加入次数的增多而减小，较高浓度(20.0 mg·kg-1)镉影响下的土壤Pmax先增大后减小，而高浓度(40.0 mg·kg-1)镉影响下的土壤Pmax呈先减小

图4镉累积效应对土壤微生物微量热曲线的影响

Fig.4Influence of Cd cumulative effect on microcalorimetric curves of soil microbacteria

表1

镉污染第28 d土壤微生物热力学参数

Tab.1

Calorimetric parameters of soil microbacteria polluted by Cd in the 28th day

后增大的趋势。(2)Qtotal与加入次数也未呈现较好的相关关系。这是因为，Pmax和Qtotal与土壤受污染的程度有关。较小程度污染会刺激微生物生长，放热量增大；但较大程度污染会造成微生物为抵抗外来污染物质消耗更多能量，放出更大热量。土壤微生物的应对污染的复杂机制导致Pmax和Qtotal未能与镉的干扰次数显示较好相关性。(3)镉分次加入的土壤生长速率常数较一次加入的大。

土壤是复杂的生态系统，对外界侵害有较强的抵抗力。当受到重金属的反复污染后，为减少背景损伤，部分土壤微生物可通过增强其生物膜进行修复，同时增强代谢活性[28]；重金属作为一种强选择压力使能对其产生抗性的微生物群落增多，土壤生态系统获得了对抗胁迫的能力，微生物恢复生长较快。

3结论

研究了外源镉的累积效应对土壤FDA水解酶活性和微生物能量代谢活性的影响。结果表明，低浓度镉对FDA水解酶活性、微生物能量代谢活性呈促进作用，高浓度镉总体表现抑制作用。随着累积干扰次数的增多，总量相同的镉对FDA水解酶活性的促进作用增大，抑制作用变小，微生物的生长速率常数变大。

由于多次干扰对土壤生态系统产生的影响较为复杂，因此还需更加深入研究微生物的响应机制。重复干扰对土壤微生物活性及土壤生态系统的长远影响还不清楚，有待深入研究。

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基金项目：国家自然科学基金重点项目(4143000452)，环保部环保公益项目(201409042)

收稿日期：2016-03-08

作者简介：罗园园(1991-)，女，河北衡水人，硕士研究生，研究方向：土壤环境毒理学，E-mail：996373788@qq.com；通讯作者：姚俊，教授，博士生导师，E-mail：yaojun@ustb.edu.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.006

中图分类号：X 53

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)07-0023-05

Cumulative Effect of Cd on Soil Microbial Activity

LUO Yuan-yuan,WU Xue-lan,LIU Wen-juan,CHAI Han-kui,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering,UniversityofScience&TechnologyBeijing,Beijing100083,China)

Abstract：Nowadays,the cumulative effect of heavy metals on soil is the main form of heavy metal pollution.The impact of repeated heavy metal pollution on soil microbial activity is a scientific problem needed to be solved urgently.The influences of Cd cumulative effect on soil FDA hydrolase activity and microbial energy metabolism activity were studied.Results showed that with the increase of adding times,the low concentration (2.0 mg·kg-1) of Cd activation on FDA hydrolase increased and the high concentration(20.0 mg·kg-1and 40.0 mg·kg-1) of Cd inhibition decreased and the microbial growth rate constant (k) increased.The microbial growth rate accelerated and the FDA hydrolase activity increased under repeated stimulation when Cd was added into the soil more than once.

Keywords：Cd;cumulative effect;soil microbacterium;FDA hydrolase;energy metabolism

罗园园，吴雪楠，刘文娟，等.镉累积效应对土壤微生物活性的影响[J].化学与生物工程，2016，33(7)：23-27.