水飞蓟素对人骨肉瘤Saos-2细胞的抑制作用及相关机制

严　晨，邬亚华，王子瑶，殷嫦嫦，殷　明

(南昌大学1.第二附属医院、2.研究生院医学部，江西 南昌　330006；3.九江学院，江西 九江　332000)



水飞蓟素对人骨肉瘤Saos-2细胞的抑制作用及相关机制

严晨1,2，邬亚华3，王子瑶1,2，殷嫦嫦3，殷明1

(南昌大学1.第二附属医院、2.研究生院医学部，江西 南昌330006；3.九江学院，江西 九江332000)

目的研究水飞蓟素对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法设置对照组及不同浓度水飞蓟素组，作用人骨肉瘤Saos-2细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化；CCK-8法测定细胞增殖；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表达。结果水飞蓟素抑制Saos-2细胞增殖，呈时间及浓度依赖性；水飞蓟素诱导Saos-2细胞凋亡，呈浓度依赖性；水飞蓟素降低Saos-2细胞p-ERK1/2蛋白表达，增加Saos-2细胞cleaved caspase-3蛋白表达，呈浓度依赖性，而ERK1/2蛋白表达无明显变化。结论水飞蓟素能够抑制人骨肉瘤Saos-2细胞增殖及诱导其凋亡，其作用机制可能与抑制ERK信号通路及上调caspase-3蛋白表达有关。

水飞蓟素；骨肉瘤；增殖；凋亡；机制；ERK信号通路；caspase-3

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常见的原发性恶性骨肿瘤，多发于儿童及青少年[1]。目前，OS的主要治疗策略为手术切除联合化疗。近年来统计，无转移OS患者的总生存率能达到70%，而出现肺转移或骨转移，生存率只有25%～50%[2]，且大剂量使用化疗药物产生严重的毒副作用及耐药的频繁发生，使得OS患者的生存率并没有得到明显提高，因此，OS的治疗需进一步探讨。研究发现，一些中药也具有抑制肿瘤细胞的作用，且毒副作用小，可作为传统化疗药物的辅助用药或联合使用，以增加化疗药物的敏感性或减少其用量，以更好的抗OS治疗。

水飞蓟素(silymarin，SM)是从植物水飞蓟中提取的一种活性成分，为多酚类黄酮，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、肝细胞再生等作用，临床已运用其治疗肝脏疾病[3]。近年来研究发现，SM对乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肺癌具有抑制作用[4-6]，但对OS的作用尚不清楚。本实验研究SM对OS的作用，并进一步探讨其可能的作用机制。

1　材料

1.1细胞系人骨肉瘤Saos-2细胞为本实验室库存。

1.2主要药品与试剂水飞蓟素(山东西亚生化科技有限公司，批号1035907)；DMSO(Solarbio公司，美国，批号02A033)；胰酶(Solarbio公司，美国，批号20150806)；α-MEM(Hyclone公司，美国，批号NAP1372)；胎牛血清(Hyclone公司，美国，批号：NYM1035)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(上海经科化学科技有限公司，批号：JK-021)；Annexin V-FITC /PI凋亡检测试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，批号：150509J)；总蛋白提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1250)；兔抗人ERK1/2单克隆抗体(Cell Signaling公司，美国，批号：14)；p-ERK1/2单克隆抗体(Cell Signaling公司，美国，批号：15)；兔抗人GAPDH(Proteintech公司，美国，批号：10494-1-AP)；cleaved caspase-3多克隆抗体(Proteintech公司，美国，批号：9677-1-AP)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(北京康为世纪生物科技有限公司，批号：1215E)。

2　方法

2.1细胞培养人骨肉瘤Saos-2细胞从液氮中复苏后，用10%胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃ 5% CO2的培养箱中培养，每3 d换液1次，待细胞汇合80%～90%后，按1 ∶3传代、培养或进行相关实验。

2.2倒置相差显微镜观察细胞形态变化取对数生长期Saos-2细胞，按每孔5×104接种于24孔板中，常规培养24 h后，按照实验分组更换含不同药物浓度的培养基，实验分6组：0 μmol·L-1(对照组)、40、80、120、160、200 μmol·L-1，作用48 h后，倒置相差显微镜观察细胞形态，并拍照。

2.3CCK-8法测定细胞增殖取对数生长期Saos-2细胞，按每孔5×103接种于96孔板中，常规培养24 h后，按照实验分组更换含不同药物浓度的培养基，实验分组同2.2，各药物浓度组均设3个复孔和1个空白孔，分别作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃培养箱中孵育2 h，酶标仪(波长450 nm)测定各孔吸光度OD(A)值。各组吸光度OD=A细胞-A空白，细胞增殖抑制率(inhibition rate, IR)：IR/%=(1-OD实验/OD对照)×100%。

2.4流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期Saos-2细胞，按每孔5×105接种于6孔板中，常规培养24 h后，按照实验分组更换含不同药物浓度的培养基，实验分组同2.2，作用48 h后，消化收集细胞，用PBS重新悬浮细胞，并计数，各组取2×105细胞悬浮液，1 500 r·min-1，5 min离心后弃上清，加入500 μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞，重悬后，先加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL PI，轻轻混匀，在室温下，避光反应10 min，行流式细胞仪检测，计算凋亡率。

2.5Western blot检测细胞内ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表达取对数生长期Saos-2细胞，按每孔5×105接种于6孔板中，常规培养24 h后，按照实验分组更换含不同药物浓度的培养基，实验分4组：对照组(0 μmol·L-1)、低浓度组(40 μmol·L-1)、中浓度组(120 μmol·L-1)、高浓度组(200 μmol·L-1)，作用48 h后，常规消化收集各组细胞，按总蛋白抽提试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白，行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，转膜，5% BSA封闭，孵育一抗GAPDH(1 ∶4 000)、ERK1/2(1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶2 000)、cleaved caspase-3(1 ∶1 000)，4℃过夜，1×TBTS洗膜3次，孵育二抗(1 ∶6 000)，1×TBTS 洗膜3次，暗室胶片曝光，条带用Image J软件进行灰度分析。

3　结果

3.1细胞形态学观察显微镜下观察显示：对照组细胞生长良好，呈梭形或不规则形，胞质透亮，胞膜光整；处理组部分细胞体积缩小、变圆，细胞内颗粒增多，胞膜边缘毛糙，折光度增强，呈细胞凋亡样形态学改变；处理组细胞数量减少，细胞间隙增宽，可见少许细胞脱壁、漂浮，随着浓度的增大，处理组上述形态学改变越明显(Fig 1 )。

A: Control group(0 μmol·L-1); B:40 μmol·L-1;C:80 μmol·L-1; D:120 μmol·L-1; E:160 μmol·L-1; F:200 μmol·L-1

Fig 2　Apoptosis rate of Saos-2 cells treated with silymarin

*P<0.05vscontrol

3.2水飞蓟素对骨肉瘤Saos-2细胞增殖的影响CCK-8结果显示：处理组均抑制骨肉瘤Saos-2细胞增殖，药物浓度越大，作用时间越长，增殖抑制越明显，与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，见Tab 1。

GroupIR/%(24h)IR/%(48h)IR/%(72h)Control00040μmol·L-110.16±2.31*14.96±2.89*18.34±1.93*80μmol·L-124.42±4.42*34.05±2.03*41.41±4.35*120μmol·L-152.01±7.81*65.01±2.78*71.62±4.44*160μmol·L-168.01±3.44*76.92±4.51*83.96±3.52*200μmol·L-180.50±2.93*87.58±2.07*92.22±2.80*

*P<0.05vscontrol

3.3水飞蓟素对骨肉瘤Saos-2细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示：水飞蓟素诱导细胞凋亡，各组细胞凋亡率分别为(2.08±0.12)%、(8.15±0.37)%、(15.37±1.06)%、(32.68±2.02)%、(48.34±1.59)%、(67.58±2.43)%，处理组浓度越高，凋亡率越大，与对照组比差异有显著性(P<0.05),见Fig 2。

3.4水飞蓟素对骨肉瘤Saos-2细胞ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表达的影响Western blot结果显示：水飞蓟素降低Saos-2细胞内p-ERK1/2蛋白表达，增加cleaved caspase-3蛋白表达，与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，而ERK1/2蛋白表达无明显变化(Fig 3)。

4　讨论

研究证实[7-10]，水飞蓟素具有预防癌症发生及抗肿瘤作用，毒副作用小，还能增加多柔比星、顺铂和卡铂的敏感性。本研究CCK-8及流式检测结果显示，水飞蓟素能够抑制Saos-2细胞增殖并诱导其凋亡，并呈浓度依赖性。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一类丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶，广泛存在于哺乳动物细胞内，MAPKs信号通路为细胞内重要信号转导通路，参与调控细胞的存活、生长、增殖、分化及凋亡等多项生理过程[11]。非磷酸化的MAPKs为静息状态，而磷酸化的MAPKs为激活状态，当MAPKs信号通路受到上游激酶作用下，发生磷酸化后而被激活，进一步激活下游转录因子，启动相关基因及蛋白表达，发挥生物学效应。研究发现，多种恶性肿瘤中MAPKs信号通路过表达或过激活，如：肝癌、肾癌、胰腺癌、食管癌[12-16]。MAPKs主要包括3个亚家族：ERK(extracellular signal-regulated kinase)家族、JNK(C-JUN-N terminal kinase)家族、p38家族，其中ERK与细胞的生长、增殖密切相关。有研究报道，水飞蓟素可通过MAPKs信号转导通路促进肺腺癌A549细胞凋亡，其中ERK1/2磷酸化明显受到抑制[17]。徐良志等[18]研究发现，大黄素通过抑制ERK信号通路，抑制骨肉瘤细胞增殖，导致细胞凋亡。caspase家族是一组半胱氨酸蛋白酶，在介导细胞凋亡过程中起到重要的作用。细胞凋亡途径有多种，但绝大多数途径末端都是通过caspase的级联激活，最终激活caspase-3，形成具有活性的cleaved caspase-3片段，进一步产生一系列级联反应，导致细胞凋亡[19]。施剑明等[20]研究发现，槲皮素、顺铂能增加骨肉瘤MG-63细胞cleaved caspase-3蛋白表达，抑制细胞增殖及促进其凋亡。本研究中，水飞蓟素作用骨肉瘤Saos-2细胞48h后，p-ERK1/2蛋白表达降低，cleaved caspase-3蛋白表达增加，呈浓度依赖性，而ERK1/2蛋白表达无明显变化,表明水飞蓟素能够抑制ERK磷酸化，阻滞ERK信号传导通路，同时上调caspase-3蛋白表达。

Fig 3　Cleaved caspase-3,ERK1/2,p-ERK1/2 protein expression of Saos-2 cells treated with silymarin for 48h detected by Western ±s,n=4)

综上所述，水飞蓟素能够抑制Saos-2细胞增殖及诱导其凋亡，可能与抑制ERK信号通路及上调caspase-3蛋白表达有关。本研究为水飞蓟素抗骨肉瘤及其作用靶点提供一定的实验参考。

(致谢:本实验在九江学院医学转化实验室完成，感谢实验室全体成员对本实验的支持与帮助！)

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Inhibitory effect of silymarin on human osteosarcoma Saos-2 cells and its mechanism

YAN Chen1,2, WU Ya-hua3, WANG Zi-yao1,2, YIN Chang-chang3, YIN Min1

(1.TheSecondAffiliatedHospitaltoNanchangUniversity，2.MedicalGraduateSchoolofNanchangUniversity，Nanchang330006,China；3.JiujiangCollege,JiujiangJiangxi332000,China)

AimTo study the effect of silymarin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma saos-2 cells and to explore its possible mechanisms.MethodsControl group and different concentration groups of silymarin were set, and Saos-2 cells were treated with silymarin. Celluar morphologic changes were observed by inverted phase contrast microscope. Proliferation of cells was tested CCK-8 assay. Apoptosis rate of cells was analyzed by flow cytometry. ERK1/2、p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 protein expression were measured by Western blot.ResultsSilymarin inhibited the proliferation of Saos-2 cells in a time-dependent and concentration-dependent manner. Silymarin induced the apoptosis of Saos-2 cells in a concentration-dependent manner. Silymarin decreased p-ERK1/2 protein expression and increased cleaved caspase-3 protein expression in a concentration-dependent manner, while ERK1/2 protein expression had no obvious change.ConculsionsSilymarin can inhibit the proliferation of human osteosarcoma saos-2 cells and induce apoptosis of them, and the mechanism may be related to inhibition of ERK signaling pathway and upregulated caspase-3 protein expression.

silymarin; osteosarcoma; proliferation; apoptosis; mechanism; ERK signaling pathway; caspase-3

2016-02-21，

2016-04-14

国家自然科学基金资助项目(No 81160226)

严晨(1986-)，男，硕士生，研究方向：中药抗骨肿瘤，E-mail:yanchen8623@163.com；殷明(1958-)，男，教授，主任医师，博士生导师，研究方向：脊柱与肿瘤，通讯作者，E-mail: yinming0791@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.016

A

1001-1978(2016)07-0966-05

R284.1；R329.24；R329.25；R738.302.2

网络出版时间：2016-6-20 11:49网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.032.html