化学合成m icroRNA-29a inhibitors和m im ics 对SD大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响

陈泽文，陶 辉，周 晓，施 鹏，张家贵，宣海洋，占红英，石开虎

化学合成m icroRNA-29a inhibitors和m im ics 对SD大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响

陈泽文，陶 辉，周 晓，施 鹏，张家贵，宣海洋，占红英，石开虎

目的 探讨微小RNA-29a（miR-29a）inhibitors和mimics对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响。方法 取SD大鼠心肌组织，以组织块酶消化法分离细胞，通过差速贴壁离心法收集、培养SD大鼠心肌成纤维细胞。应用LipofectamineTM2000 Reagent分别向大鼠心肌成纤维细胞瞬时转染miR-29a inhibitors和miR-29amimics24 h和48 h后，实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-29a、Ⅰ型胶原前胶原A1（Col1A1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的RNA水平的表达，MTT法检测细胞增殖活性。结果 与正常对照组和阴性对照组比较，在瞬时转染miR-29a inhibitors的心肌成纤维细胞中，miR-29a的表达水平下调；而在转染miR-29a m imics的心肌成纤维细胞中，miR-29a的表达水平上调。Col1A1在miR-29a inhibitors组中表达水平升高，而在miR-29am imics组中则表达水平降低。α-SMA在miR-29a inhibitors组中表达水平升高，在miR-29a mimics组中则表达水平降低。瞬时转染miR-29am imics 24、48 h后，与空白对照组和其阴性对照组相比较，心肌成纤维细胞活力明显下降；而瞬时转染miR-29a inhibitors 24、48 h后，心肌成纤维细胞活力则明显增强。结论 miR-29am imics可明显抑制心肌成纤维细胞增殖活性，而miR-29a inhibitors则显著提高心肌成纤维细胞的增殖活性，提示心肌纤维化的形成可能与miR-29a表达下调有关，其潜在的分子作用机制有待进一步研究。

microRNA-29a；心肌成纤维细胞；Col1A1；α-SMA；quantitative real-time PCR

网络出版时间：2016-3-8 8：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.016.htm l

心肌纤维化是心房颤动（atrial fibrillation，AF）的病理生理学基础，可导致心律失常的发生和持续［1］。心肌纤维化表现为细胞外基质（extracellular cellmatrix，ECM）和胶原蛋白的过度沉积，最终导致心肌功能的损害。在此过程中，心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）发挥着重要的作用，其活化增殖则是心肌纤维化的关键环节［2-3］。心肌纤维化形成的详细机制目前尚未完全明确，然而现有研究［4］表明已有不少miR涉及心脏疾病的发生发展，其被称为心脏微小RNA。miR是一类短链、高度保守的非编码RNA，在干扰转录和基因表达方面起着重要的调控作用［3］。miR-29a作为miR-29家族中的一员，已被证实在心肌纤维化中表达水平有显著变化［5］。该研究通过观察miR-29a在大鼠CFs活化中的表达变化，初步探讨miR-29a在心肌纤维化中的作用，为心肌纤维化的预防和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD乳鼠60只，出生1 ～3 d，平均体重8 g，由安徽医科大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂 HyCloneⓇDMEM/High Glucose培养基、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清购自英国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国 Wisent公司；miR-29a inhibitors和miR-29a mimics、EzOmicsmiRNA qPCR Detection Primer试剂盒和EzOmics One-Step qPCR试剂盒购自美国Biomic公司；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；Opti-MEMⓇI（1×）购自美国Life Technologies公司；MTT相关试剂购自美国Sigma公司；转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）购自美国Peprotech公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要仪器 NAPCO-6100型细胞培养箱（美国SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超净工作台（苏州泰安空气技术有限公司）；eppendorf Centrifuge 5417R高速冷冻离心机（德国eppendorf公司）；StepOneⓇReal-Time PCR System（美国ABI公司）；NanoPhotometer P-Class分光光度仪（德国Implen GmbH公司）；酶标仪MK3（荷兰雷勃公司）。

1.4 方法

1.4.1 CFs的提取与细胞培养 取出生3～5 d内的SD大鼠于75%乙醇溶液缸中浸泡20 s后，转移至超净台。用无菌剪刀取出心脏，置于高压蒸汽灭菌过的培养皿中。将大鼠心脏全部取出后，尽量完全剔除心脏上的心房、结缔组织、脂肪和血管，预冷PBS液冲洗3次以去除血污。将心脏转移至离心管后剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，加入酶消化液3 ml、37℃水浴并振荡15 min，自然沉降1 min后吸取上清液入新离心管，加入3 ml 37℃的DMEM培养基终止消化，混匀后以900 r/min离心9 min，反复操作3次，弃上清液，细胞沉淀加入4 ml、37℃的含10%胎牛血清的DMEM培养基吹散细胞后，接种于培养瓶中，2 h后使用差速离心贴壁法分离以保留CFs。在5%CO2、37℃培养箱中放置过夜。培养CFs至80%～90%汇合状态时，采用胰蛋白酶予以消化传代培养，取2～4代细胞用于实验，经倒置显微镜、免疫组化方法鉴定为CFs。

1.4.2 瞬时转染miR-29a inhibitors和mimics 取对数生长期CFs进行转染实验。转染前1 d，将CFs细胞计数后，接种于6孔板，用Opti-MEM稀释待转染。成熟miR-29a inhibitors/mimics由美国Biomic生物技术公司设计并合成。引物序列如下：miR-29a mimics上游引物：5′-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3′，下游引物：5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′；miR-29a inhibitors引物序列：5′-UAACCGAUUUCAGAUGGUGCUA-3′。将 miR-29a inhibitors和mimics及其阴性对照分别与脂质体LipofectamineTM2000 Reagent轻吹混匀，室温静置20 min后，加入相应各孔细胞中，37℃、5%CO2保温箱孵育24 h，更换含血清及双抗的DMEM完全培养基并用浓度为10 ng/m l的TGF-β1刺激细胞生长，转染48 h后提取转染后细胞的总RNA。

1.4.3 总RNA提取和一步法qRT-PCR检测miR-29a 检测转染后CFs中的miR-29a含量，用StepOneⓇReal-Time PCR系统进行qRT-PCR检测。采用TRIzol并根据操作手册一步法抽提细胞总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，通过计算吸光度（absorbance，A）值，A260/A280的比值了解其纯度并选取比值在1.8～2.0的RNA样品进行试验。采用EzOmics miRNA qPCR Detection Primer试剂盒与EzOmics One-Step qPCR试剂盒并参照操作手册检测miR-29a。反应条件如下：42℃、30 min，95℃、10 min，接着95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s共40循环的扩增阶段条件；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s的溶解曲线阶段条件。以U6作为内参，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。

1.4.4 qRT-PCR法检测Col1A1和α-SMA mRNA表达 总RNA用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒并参照操作手册逆转录合成cDNA，然后应用Maxima SYBR Green/ ROX qPCR Master Mix（2×）试剂盒并参照操作手册进行qRT-PCR检测。从GenBank中查找引物序列并设计合成相应引物。引物序列如下：鼠源Col1A1上游引物：5′-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACTTT TTGG-3′，下游引物：5′-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3′。鼠源α-SMA上游引物：5′-TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT-3′，下游引物：5′-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT-3′。鼠源β-actin上游引物：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′，下游引物：5′-ACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′。反应条件如下：50℃、2 min，95℃、10min，接着95℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s共50个循环的扩增阶段条件；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s的溶解曲线阶段条件。以β-actin作为内参，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。

1.4.5 MTT比色法检测细胞增殖 检测前设计分组：转染miR-29a inhibitors组、转染 miR-29a mimics组、阴性对照组和空白对照组。将处于对数生长期的各组CFs用胰蛋白酶消化后，完全培养基重悬形成细胞悬液。用血球计数板进行细胞计数。以每孔1×104的密度铺于96孔板中，每组5个复孔，每孔200μl，连续监测2 d，铺板过程中要确保每孔加入细胞数一致。置于37℃、5%CO2培养箱培养。从铺板后第2天开始，每孔加入5 g/LMTT，继续培养4 h，吸取培养上清液，每孔加入200μl DMSO，室温下摇床振荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解，在酶标仪上测定各孔波长490 nm处A值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，数据以±s表示。单变量两组资料间的比较采用t检验，多组均数的比较采用方差分析。所有实验数据分析重复至少3次。

2 结果

2.1 瞬时转染m iR-29a m im ics、inhibitors对m iR-29a的表达影响 瞬时转染CFsmiR-29amimics、in-hibitors及其阴性对照48 h后，One-step Real-time qPCR结果显示，转染miR-29a mimics后，与正常对照组和阴性对照组比较，实验组miR-29a的表达显著上调，差异具有统计学意义（t=13.56、13.86，P＜0.05），转染miR-29a inhibitors后，与正常对照组和阴性对照组比较，实验组miR-29a的表达明显下降，差异有统计学意义（t=9.23、8.65，P＜0.05）。见图1。

图1 瞬时转染48 h后各组CFs内　m iR-29a的表达变化1：阴性对照组；2：空白对照组；3：转染　miR-29a mimics组；4：转染　miR-29a inhibitors组；与空白对照组比较：*P＜0.05；与阴性对照组比较：##P＜0.01

2.2瞬时转染m iR-29a m im ics、inhibitors对Col1A1和α-SMA的表达影响 瞬时转染CFs miR-29a mimics、inhibitors及其阴性对照48 h后，Real-time qPCR结果显示，转染miR-29amimics后，与正常对照组和其阴性对照组比较，实验组Col1A1和α-SMA的表达水平明显下调，差异有统计学意义（Col1A1：t=7.31、7.22，P＜0.05；α-SMA：t=5.45、5.67，P＜0.05），转染miR-29a inhibitors后，与正常对照组和其阴性对照组比较，实验组Col1A1和α-SMA的表达水平显著上升，差异有统计学意义（Col1A1：t=10.14、10.27，P＜0.05；α-SMA：t= 9.75、9.83，P＜0.05）。见图2。

图2 瞬时转染48 h后各组CFs内　Col1A1和　α-SMA的表达变化1：阴性对照组；2：空白对照组；3：转染　miR-29a mimics组；4：转染miR-29a inhibitors组；与空白对照组比较：*P＜0.05；与阴性对照组比较：##P＜0.01

2.3 瞬时转染m iR-29a m im ics、inhibitors对CFs活化增殖的影响 瞬时转染CFs miR-29a mimics 24、48 h后，与空白对照组和其阴性对照组比较，实验组CFs活力明显下降，差异有统计学意义（F= 35.46、33.57，P＜0.05），而瞬时转染CFsmiR-29a inhibitors24、48 h后，与空白对照组和其阴性对照组比较，实验组CFs活力明显增强，差异有统计学意义（F=21.23、25.18，P＜0.05）。见图3。

图3 瞬时转染48 h后各组　CFs增殖活性变化1：阴性对照组；2：空白对照组；3：转染　miR-29a mimics组；4：转染　miR-29a inhibitors组；与空白对照组比较：*P＜0.05；与阴性对照组比较：##P＜0.01

3 讨论

CFs是心脏中数量最多的细胞，在心肌纤维化中发挥重要的调控作用。在心肌纤维化的过程中，CFs受到TGF-β1、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子刺激，分化为以α-SMA为表面标志物肌成纤维母细胞，有较强的胶原分泌能力［6］。因此，心肌纤维化主要是通过CFs活化增殖成肌成纤维母细胞，促进Col1A1和α-SMA等的过度表达，使得ECM蛋白和胶原过度沉积，导致纤维化发生。

研究［3］表明，miR在纤维化器官尤其是心脏中起着重要的作用。如心梗大鼠敲除miR-21基因后，心肌纤维化水平降低，表明miR-21高表达可促进CFs的增殖［7］。miR-24可以维持TGF-β表达水平的稳定，以此以减少心肌纤维化的发生［8］。miR-29大多由成纤维细胞生成，miR-29家族是纤维化的关键调节因子，调节胶原和其他ECM基因在mRNA水平上的表达［9］。一方面，miR-29可以通过下调抗凋亡基因以促进心肌细胞凋亡；另一方面，miR-29可以抑制胶原生成，从而产生抗纤维化的作用。此外，miR-29a则可以通过上调RASSF1A表达水平，降低心肌纤维化水平［10］。miR-29a inhibitors和mimics分别是miR-29a的抑制剂和促进剂，可以分别抑制和促进miR-29a的表达，然而miR-29a在CFs活化增殖中具体的调控模式尚不十分清楚。

本研究用miR-29a inhibitors和mimics转染体外培养的新生SD大鼠CFs，检测转染后CFs的增殖变化以及miR-29a、Col1A1和α-SMA的表达水平。结果表明miR-29amimics可明显抑制CFs的增殖活性，降低Col1A1和α-SMA的表达水平；而miR-29a inhibitors则表现为促进CFs的增殖活性。

综上所述，miR-29a mimics转染CFs后，miR-29a表达上升，而CFs中miR-29a的高表达可以抑制其活化增殖，抑制心肌纤维化的发生发展，表明miR-29a是CFs活化增殖的潜在的靶向分子，这为预防和治疗心肌纤维化提供新思路。

［1］ Santulli G，Iaccarino G，De Luca N，et al.Atrial fibrillation and microRNAs［J］.Front Physiol，2014，5：15.

［2］ Santulli G，D＇ascia SL，D＇ascia C.Development of atrial fibrillation in recipients of cardiac resynchronization therapy：the role of atrial reverse remodelling［J］.Can JCardiol，2012，28（2）：245.e17-8.

［3］ 张 猛，陶 辉，陈泽文，等.化学合成microRNA-21 inhibitors对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响［J］.安徽医科大学学报，2015，50（5）：577-81.

［4］ Kotoh M.Cardio-miRNAs and onco-miRNAs：circulatingmiRNA-based diagnostics for non-cancerous and cancerous diseases［J］. Front Cell Dev Biol，2014，2：61.

［5］ 郝 嘉，游 凯，肖颖彬.心肌成纤维细胞的特性和调节［J］.心血管病学进展，2011，32（3）：405-8.

［6］ Chen P Y，Qin L，Zhuang Z W，et al.The docking protein FRS2αis a critical regulator of VEGF receptors signaling［J］. Proc Natl Acad Sci U SA，2014，111（15）：5514-9.

［7］ Cardin S，Guasch E，Luo X，et al.Role formicroRNA-21 in atrial profibrillatory fibrotic remodeling associated withexperimental postinfarction heart failure［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，5（5）：1027-35.

［8］ Wang J，Huang W，Xu R，et al.MicroRNA-24 regulates cardiac fibrosis aftermyocardial infarction［J］.JCell Mol Med，2012，16 （9）：2150-60.

［9］ Tan J，Tong B D，Wu Y J，et al.MicroRNA-29 mediates TGFβ1-induced extracellular matrix synthesis by targeting wnt/β-catenin pathway in human orbital fibroblasts［J］.Int JClin Exp Pathol，2014，7（11）：7571-7.

［10］Tao H，Yang J J，Chen ZW，et al.DNMT3A silencing RASSF1A promotes cardiac fibrosis through upregulation of ERK1/2［J］. Toxicology，2014，323：42-50.

Effect ofm icroRNA-29a inhibitors and m im ics on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats

Chen Zewen，Tao Hui，Zhou Xiao，et al
（Dept of Cardio-Thoracic Surgery，The Second Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Dept of Cardiovascular Disease Research Center，AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To explore the effection ofmiR-29a inhibitors and mimics on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats.Methods Cardiac fibroblasts were isolated from newly born male SD rats.miR-29a inhibitors or mimics was transfected respectively into cardiac fibroblasts through LipofectamineTM2000 Reagent. Twenty-four and Forty-eight hours after transfection，the expressions ofmiR-29a andmRNA of Col1A1 andα-SMA were analyzed by qRT-PCR.MTT assay was used to detect the proliferation activity of the transfected cardiac fibroblasts.Results Compared with normal group and negative group，expression ofmiR-29a was down-regulated in miR-29a inhibitors group while up-regulated inmiR-29amimics group.Col1A1mRNA expression was up-regulated in miR-29a inhibitors group while down-regulated inmiR-29amimics group.α-SMAmRNA expression was up-regulated in miR-29a inhibitors group while down-regulated inmiR-29amimics group.The cardiac fibroblasts proliferation activity decreased significantly after transfectedmiR-29amimicswhile increased in miR-29a inhibitors groups. Conclusion miR-29amimics can suppress the proliferation activity of cardiac fibroblasts significantly，implicating miR-29a as a potential target for cardiac fibroblasts activation and proliferation and pointing to this result can provide new way of thinking of interventions designed to prevent the cardiac fibrosis occurrence and development.

microRNA-29a；cardiac fibroblasts；Col1A1；α-SMA；qRT-PCR

R 542.2

A

1000-1492（2016）04-0493-04

2015-12-21接收

国家自然科学基金资助项目（编号：81570295）；安徽省自然基金（编号：1308085MH117、1408085MH175）

安徽医科大学第二附属医院心胸外科、安徽医科大学心血
管病研究中心，合肥 230601

陈泽文，男，硕士研究生；
石开虎，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：shikaihu@gmail.com