瘦素预处理经线粒体通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

王文艳，徐彤彤，戴春光，白 准

瘦素预处理经线粒体通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

王文艳1，2，徐彤彤2，戴春光3，白 准4

目的 探讨在SD大鼠心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中瘦素预处理经线粒体信号通路对机体的影响及相关机制。方法 选取健康雄性成年SD大鼠50只，随机分为缺血再灌注（IR）模型对照组（模型组，线栓法制作大鼠IR模型）、假手术组（仅开胸不作血管结扎）、IR瘦素预处理低、中、高剂量（20、50、100μg/kg）共5组，每组10只。各组大鼠经缺血半小时再灌注24 h，观察心肌HE染色病理形态学变化；ELISA法检测血清中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）和线粒体通透性转换孔（mPTP）的含量；Western blot法检测凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、凋亡相关基因（Bax）的表达。结果 与模型组比较，假手术组及瘦素预处理组心肌病理学表现减轻，IL-6、TNF-α、mPTP及Bax表达显著降低（P＜0.05），Bcl-2在瘦素预处理组中表达显著增高，且在瘦素高剂量组中表达最高（P＜0.05），均无明显剂量依赖性。结论 瘦素可缓解MIRI的炎症反应及mPTP的开放，并促进线粒体通路相关蛋白Bcl-2上调，使Bax蛋白的表达下调，从而保护心肌细胞减轻损伤。

瘦素预处理；心肌缺血再灌注损伤；线粒体通路

网络出版时间：2016-3-8 8：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.010.htm l

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）时所释放的损伤因子对线粒体产生破坏，促使线粒体变形、破损、基质外流，导致线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放增多及相关凋亡蛋白如B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、凋亡相关基因（Bax）等的释放，从而对机体造成损伤［1］。近年来mPTP与MIRI之间的关系已成为各学者的研究热点。瘦素已被证实与MIRI之间存在着重要的联系，但瘦素在MIRI中对线粒体通路的影响尚需要进一步研究［2］。该研究旨在建立大鼠心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）模型，并术前予以不同剂量瘦素进行处理，观察心肌组织病理情况，并测定血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及mPTP的变化及心肌Bcl-2、Bax的表达，为改善MIRI提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验对象 SD成年雄性大鼠50只，约250 g，购自桂林医学院实验动物房。将50只大鼠随机分为IR模型对照（模型组）、假手术组、IR瘦素低剂量预处理（低剂量组）、IR瘦素中剂量预处理（中剂量组）、IR瘦素高剂量预处理（高剂量组），每组各10只。

1.2 主要试剂和仪器 重组大鼠瘦素（美国R&D Systems公司）；IL-6和TNF-α酶联免疫试剂盒（北京奥博森生物科技有限公司）；mPTP酶联免疫试剂盒（上海铭睿生物科技有限公司）；Bcl-2、Bax及GAPDH抗体（中国万类生物公司）。仪器包括低温及高速离心机、小动物专用呼吸机、动物心电图仪、超低温冰箱、电泳仪、转膜仪、Leica正置显微镜、酶标仪等。

1.3 方法

1.3.1 MIRI模型的制备 各组大鼠术前禁食禁饮12 h，MIRI模型的制备采用线扎大鼠的冠状动脉左前降支。瘦素预处理组在术前30 min按浓度分组进行腹腔注射重组大鼠瘦素，予以浓度3 mg/kg水合氯醛腹腔注射进行麻醉后将大鼠固定于手术台上，四肢接动物心电图仪，观察术前心电图Ⅱ导联变化。取颈部及胸前区进行备皮，作颈部竖切口，钝性分离颈部肌肉暴露气管，用蝶形静脉留置针刺入气管并拔出针芯后接小动物专用呼吸机（呼吸频率60 次/min，呼吸比2∶1，潮气量约16 m l），监测心电图稳定后进行开胸结扎冠状动脉左前降支。胸部作胸骨左缘竖形切口，钝性分离胸前区肌肉及第2～3肋骨间隙，暴露心脏。使用眼科镊提起心包膜，剪破心包膜并使用小拉钩分离心包膜于切口两侧，用湿棉签轻压心脏向前右旋转至可见左心耳。于左心耳下约2 mm处使用无创小圆针在左前降支血管处进针，深度约1 mm，留置硅胶管后留线结扎。心肌缺血模型成功标志：肉眼可见所扎血管心肌部分颜色改变为暗红、苍白或肿胀，心电图Ⅱ导联可见心率较前减慢或出现心律失常，并可见ST段较前明显抬高。缺血30 min后，拔出硅胶管，留线缝合胸壁及胸前皮肤。假手术组仅穿针过冠状动脉左前降支留线不进行结扎。

1.3.2 心肌组织病理切片 取部分左心室肌，用冰生理盐水冲洗后于10%多聚甲醛溶液固定，并石蜡包埋、切片、HE染色，最后于Leica正置显微镜下观察各组心肌的病理学变化。

1.3.3 ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α及mPTP的表达 再灌注后取各组大鼠股动脉血约5 m l于肝素抗凝管中，置低温离心机中以3 000 r/min离心5 min，分离血清于EP管中，并置于-80℃冰箱保存待测，各组检测均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 Western blot法检测心肌中Bcl-2和Bax蛋白表达的变化 取超低温冰箱下冻存心肌60 mg捣碎后提取每组心肌组织总蛋白，应用BCA法进行蛋白定量，以每泳道20μg上样量进行SDS-PAGE电泳，转膜仪将蛋白转上PVDF膜，常温下封闭1 h，加Bcl-2和Bax（1∶1 000稀释）一抗，4℃孵育过夜后使用TBST洗膜，按1∶10 000稀释相应二抗，室温孵育1 h再使用TBST洗膜后，用化学发光法显影检测目的蛋白的表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料以±s表示。多组间比较使用单因素方差分析。

2 结果

2.1 心肌组织HE染色 假手术组HE染色显示心肌纤维排列规整，呈束状，无红细胞渗出及炎症细胞浸润；模型组再灌注后可见心肌纤维排列紊乱，部分胞核消失，出现大量泡沫细胞及红细胞渗出，有炎症细胞浸润现象；瘦素处理组与模型组比较，可见泡沫细胞减少，心肌纤维排列紊乱减轻，组织间质增宽，但红细胞渗出少。见图1。

2.2 血清IL-6、TNF-a及m PTP的表达 与假手术组比较，余4组IL-6、TNF-α、mPTP水平均表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，瘦素预处理组IL-6、TNF-α、mPTP水平均降低（P＜0.05），无剂量依赖性表现。见表1。

图1 心肌染色结果 HE×200A：模型组；B：假手术组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组

表1 血清 IL-6、TNF-α、m PTP水平改变（n=10，±s）

表1 血清 IL-6、TNF-α、m PTP水平改变（n=10，±s）

与模型组比较：*P＜0.05；与假手术组比较：#P＜0.05

组别　IL-6（pg/m l）　TNF-α（pg/ml）　mPTP（pg/m l）模型　74.53±3.39#　81.43±3.49#　0.54±0.05#假手术　20.13±1.96　6.71±0.80　0.070±0.006低剂量　46.77±2.27*#　44.93±5.09*#　0.32±0.02*#中剂量　54.77±4.05*#　62.17±3.68*#　0.38±0.02*#高剂量　40.10±1.48*#　31.67±3.07*#　0.24±0.05*#F值152.48　198.68　78.51

2.3 心肌组织中Bcl-2和Bax的表达 与假手术组比较，低剂量组及高剂量组Bcl-2表达上调（P＜0.05），Bax在模型组及瘦素处理组中表达均上调；与模型组比较，Bcl-2在瘦素处理组中表达显著上调，且在瘦素高剂量组中表达最高（P＜0.05）；Bax在瘦素预处理中表达显著下调，且在瘦素高剂量组中表达最低（P＜0.05），均无明显剂量依赖性。见图2。

3 讨论

研究［3-4］表明MIRI与细胞凋亡有重要的联系，并发现线粒体功能的改变与细胞凋亡紧密相关，如线粒体释放相关凋亡蛋白、氧自由基产生过多、胞质钙离子失衡等。在再灌注期会发生大量mPTP开放，因而在MIRI中mPTP对相关凋亡蛋白等因子的释放起着关键作用［5］。线粒体通路引发的凋亡主要与Bcl-2和Bax蛋白有关，Bax是Bcl-2的同源二聚体，两者均表达于线粒体外膜、内质网膜、核膜。正常状态下，当机体出现损伤时，Bcl-2可介导聚集核内谷胱甘肽，抵消氧自由基的产生，并阻断钙离子通道对细胞进行保护，相反，Bax表达增高可促进细胞 凋 亡［6-7］。

瘦素与大鼠或小鼠MIRI存在密切联系，在MIRI中，经瘦素处理后影响超氧化物歧化酶1 （SOD1）、丙二醛（MDA）、IL-6、TNF-α等因子，通过减轻炎症反应及氧化应激损伤对机体进行保护［8-9］。研究［10］显示磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸（苏氨酸）蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路参与MIRI的调控，而Bcl-2/Bax是PI3K/Akt的下游信号蛋白，均参与线粒体通路，瘦素也被证实与PI3K/Akt信号通路有着密切联系。

本研究在制作大鼠MIRI模型的前提下探讨瘦素预处理经线粒体通路对大鼠 MIRI的影响，结果显示瘦素预处理组心肌病理学表现较模型组缓解，血清中炎性因子IL-6、TNF-α及mPTP表达降低，表明瘦素减轻了炎症反应并阻止了mPTP的开放，且促凋亡蛋白Bax表达下调，而抑凋亡蛋白Bcl-2表达上调，从而显示瘦素可能经线粒体通路对大鼠MIRI起到了保护作用，但其相关机制的信号蛋白仍需进一步探究。

图2 各组大鼠心肌组织中　Bcl-2、Bax蛋白的表达水平（n=10，±s）1：模型组；2：假手术组；3：低剂量组；4：中剂量组；5：高剂量组；与模型组比较：*P＜0.05；与假手术组比较：#P＜0.05

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Effects of leptin pretreatm ent via m itochondrial pathway on m yocardial ischem ia reperfusion injury in rats

Wang Wenyan1，2，Xu Tongtong2，Dai Chunguang3，et al
（1Grauate School of Guilin Medical University，GuiLin 541004；
2SpecialWards，3ICU，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，GuiLin 541001）

Objective To investigate the effect and relevantmechanism of leptin pretreatment via mitochondrialsignaling pathway on myocardial ischemia-reperfusion injury in SD rats.Methods 50 healthymale adult SD rats were randomly divided into 5 groups，model group（tomake ischemia-reperfusion model by suturemethod），sham group（thoracotomy without vascular ligation），the low，medium and high dose leptin pretreatment groups（20，50，100μg/kg，n=10）.After ischemia for 30 minutes and reperfusion for 24 hours，then to observe the pathological changes of cardiac HE staining in rats；using ELISA to test serum interleukin-6（IL-6），tumor-stimulating factorα（TNF-α）and mitochondrial permeability transition pore（mPTP）；to test the expression of Bcl-2 and Bax apoptotic proteins by Western blotmethod.Resu lts Compared with the model group，pathological characteristics of sham group and leptin preconditioning groups were improved；IL-6，TNF-α，mPTP and Bax expression was significantly decreased（P＜0.05）；in leptin pretreatmentgroups，Bcl-2 expression was significantly increased，especially in high dose leptin group（P＜0.05），and there was no obvious dose-dependence.Conclusion Leptin relieve inflammation and inhibitemPTP，up-regulate the expression of Bcl-2 and down-regulate the Bax，thereby protecte cardiomyocytes and mitigate damage on MIRI.

leptin pretreatment；myocardial ischemia reperfusion injury；mitochondrial pathway

R 541.4

A

1000-1492（2016）04-0481-04

2015-12-21接收

桂林市科学研究与技术开发计划课题（编号：20130120-1）；广西医疗卫生适宜技术研究与开发课题（编号：S201316-03）；广西科学研究与技术开发计划项目（编号：桂科能1598025-29）

1桂林医学院研究生院，桂林 541004桂林医学院附属医院2特需病区3重症医学科，桂林541001
4株洲市中心医院重症医学科，株洲 412000

王文艳，女，硕士研究生；
徐彤彤，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：xutongtongguilin@163.com