锌对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与向神经样细胞分化的影响

严　珺，王永杰，孟春阳，李　雷，赵嘉勋，郭贵君，彭川莉，尹　飞，郭　丽*

(1．吉林大学公共卫生学院 卫生毒理学教研室，吉林 长春130021；2．吉林大学中日联谊医院 骨科,吉林 长春130033)



锌对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与向神经样细胞分化的影响

严珺1，王永杰1，孟春阳2，李雷1，赵嘉勋1，郭贵君1，彭川莉1，尹飞2，郭丽1*

(1．吉林大学公共卫生学院 卫生毒理学教研室，吉林 长春130021；2．吉林大学中日联谊医院 骨科,吉林 长春130033)

摘要：目的探讨锌对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)增殖及向神经样细胞诱导分化的作用。方法贴壁法体外分离培养BMSCs，MTT法检测不同浓度的锌处理BMSCs 24 h、48 h及72 h后增殖活性。免疫细胞化学法检测不同浓度的锌处理BMSCs Ki67的表达。BMSCs分空白对照组、缺锌诱导组、正常诱导组、低浓度锌处理组和高浓度锌处理5组。除空白对照组外，其余4组在含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)诱导分化培养基中培养5 d，维甲酸继续培养14 d，诱导BMSCs向神经样细胞分化。倒置显微镜观察细胞生长形态；免疫细胞化学法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果MTT结果显示，细胞暴露在锌浓度为200×10-7mol/L时，不同时间点细胞活力均最强；免疫细胞化学法显示：缺锌组Ki67阳性表达显著低于空白对照组(P<0.05)，低浓度锌处理组Ki67阳性表达显著高于空白对照组、缺锌组和高浓度锌处理组(P<0.05)；缺锌组、正常诱导组和低浓度锌处理组GFAP和NSE阳性率显著高于空白对照组和高浓度锌处理组(P<0.05)，正常诱导组和低浓度锌处理组的GFAP和NSE阳性率显著高于缺锌组(P<0.05)，低浓度锌处理组的GFAP和NSE阳性率均显著高于正常诱导组(P<0.05)。结论锌在一定浓度范围内能够提高BMSCs增殖能力及促进BMSCs向神经样细胞分化。

关键词：骨髓间充质干细胞；锌；增殖；分化

(ChinJLabDiagn,2016,20:1045)

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类可以自我更新、具有强大增殖能力以及多向分化潜能的干细胞[1，2]。有研究证实，通过化学等诱导物在体内或体外适宜条件下可以使BMSCs分化为神经样细胞，为修复中枢神经系统退行性疾病以及神经功能障碍带来新的希望，引起越来越多的各界学者的关注[3，4]。但BMSCs在体外经过几次传代培养后，细胞的增殖及分化潜能下降，因此人们一直寻找增加BMSCs增殖和分化功能的处理因素。锌是细胞中各种酶的必需组成成分，在机体的生长发育中扮演重要角色。有研究证明，锌不仅对神经干细胞的存活有着重要影响，而且对其增殖、分化以及诱导产生神经元起关键作用[5，6]。但对于锌在BMSCs向神经样细胞分化过程中的作用研究却较少。本研究对锌对BMSCs的增殖和向神经样细胞分化影响作用进行了探讨。

1材料与方法

1.1动物和主要试剂一周龄健康SD大鼠，购自吉林大学实验动物中心；碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)购自PeproTech公司；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体购自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分离培养一周龄SD大鼠置于超净工作台中，脱颈处死，于75%酒精灭菌，无菌条件下将骨髓腔中的细胞冲入含DMEM-F12培养液的广口瓶中，制成单细胞悬液，以1×106/mL细胞密度接种于75 mL培养瓶，于5%CO2、饱和湿度孵箱中培养。3 d后换半液，7 d左右以1∶2传代。

1.2.2Zn对BMSCs增殖的影响①MTT法 将第三代BMSCs细胞悬液，以每孔5×103个细胞、200 μl的密度接种于96孔培养板。次日分别换成不同浓度硫酸锌(ZnSO4·7H2O)(0、50×10-7、100×10-7、200×10-7、400×10-7、800×10-7、1 600×10-7、3 200×10-7)mol/L的培养液，设4个复孔，培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μl，孵育4 h，在490 nm波长的酶联检测仪上测量各孔吸光度值(OD值)，计算细胞活力。②细胞增殖抗原Ki67的检测待第三代BMSCs细胞长满盖玻片后分空白对照组、缺锌组(每毫升血清中添加0.1 g Chelex-100螯合树脂)、低浓度锌处理组(200×10-7mol/L)、高浓度锌处理组(1600×10-7mol/L)四组，培养3 d。预冷的95%乙醇固定20 min，干燥后-20℃保存用于免疫细胞化学法检测。

1.2.3BMSCs的分化待第三代BMSCs细胞长满盖玻片后分空白对照组、缺锌组(Chelex-100螯合树脂+诱导剂)、正常诱导组、低浓度锌处理组(200×10-7mol/L Zn+诱导剂)、高浓度锌处理组(1600×10-7mol/L Zn+诱导剂)五组(低、高锌浓度由MTT筛选)。除空白对照组外，其他组在含有bFGF、EGF诱导分化培养基中培养5 d，维甲酸继续诱导14 d。95%预冷的乙醇固定20 min，晾干、-20℃保存。

1.2.4免疫细胞化学法检测GFAP、NSE蛋白以及Ki67蛋白的阳性表达取出细胞片，0.5%Triton X-100溶液孵育20 min，内源性过氧化物酶阻断剂孵育30 min，动物非免疫血清封闭30 min，一抗孵育(Ki67、GFAP、NSE，1∶200)过夜，生物素标记的第二抗体孵育30 min，链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶30 min， DAB显色，苏木精染核，脱水、透明，封片，显微镜观察。

2结果

2.1BMSCs的培养

细胞接种于培养瓶24 h后见少量细胞贴壁，细胞形态多为圆形。48 h后贴壁细胞逐渐增加，形成大小不同的细胞集落。72 h后细胞逐渐增大，呈长梭形或多角形，换半液。7 d后传代，传代后细胞以梭形为主。

2.2Zn对BMSCs增殖的影响

2.2.1MTT结果MTT结果显示，BMSCs在暴露于不同浓度Zn2+24 h、48 h和72 h的条件下，细胞在200×10-7mol/L浓度时，BMSCs活力达到最顶峰，显著高于对照组(P<0.05)(见图1)。结果表明在一定剂量范围(0-200×10-7mol/L)内，随着Zn浓度增长，细胞增殖能力增强，在Zn浓度为200×10-7mol/L时，活力最强。随着锌浓度进一步增加(200×10-7mol/L-1600×10-7mol/L)，细胞活力下降；随着作用时间的增加，细胞活力下降。

2.2.2增殖抗原Ki67的表达免疫细胞化学法显示，缺锌诱导组Ki67阳性表达显著低于空白对照组(P<0.05)，低浓度锌处理组Ki67阳性表达显著高于空白对照组与缺锌诱导组(P<0.05)，高浓度锌处理组Ki67阳性表达显著低于空白对照组和低浓度锌处理组(P<0.05)(见图2)。

图1　不同时间点不同浓度锌对BMSCs细胞活力增殖曲线

A.空白对照组400×；B.缺锌组400×；C.低浓度锌处理组400×；D.高浓度锌处理组400×；E.aP<0.05，与空白对照组比较；bP<0.05，与缺锌组比较；cP<0.05，与低浓度锌处理组比较

图2免疫细胞化学检测增殖抗原Ki67的表达

2.3诱导BMSCs分化的神经样细胞标志蛋白的表达

免疫细胞化学法显示，不同组有不同程度GFAP和NSE的表达。与空白对照组比较，缺锌组、正常诱导组和低浓度锌处理组GFAP和NSE阳性率均显著升高(P<0.05)；同时，与缺锌组比较，正常诱导组和低浓度锌处理组的GFAP和NSE阳性率均显著升高(P<0.05)，与正常诱导组比较，低浓度锌处理组的GFAP和NSE阳性率均显著升高(P<0.05)，高浓度锌处理组的GFAP和NSE阳性率显著低于缺锌组、正常诱导组和低浓度锌处理组(P<0.05)(见图3)。

3讨论

近年来研究发现，由于BMSCs不存在取材困难以及伦理之争等诸多优势已经作为组织工程及细胞和基因治疗的种子细胞[7]。BMSCs在适宜诱导条件下，能够定向分化为神经样细胞，为治疗中枢神经系统损伤和退行性疾病带来新的希望。

aP<0.05，与空白对照组比较；bP<0.05，与缺锌组比较；cP<0.05，与正常诱导组比较；dP<0.05，与低浓度锌处理组比较

图3诱导BMSCs分化的神经样细胞标志蛋白的表达

本研究对锌在BMSCs向神经样细胞分化过程中的作用进行了探讨，锌作为生物体重要的营养物质，在细胞的生化过程中发挥不同的作用，包括生长、分裂以及酶系统的活动中都体现着重要功能[8]。本实验采用不同处理组来研究锌对BMSCs增殖活力的影响，MTT结果表明在达到阈值之前，随着Zn浓度增加，细胞增殖活力增强，锌含量过高不利于细胞增殖，细胞活力下降。Ki67是与细胞增殖相关的抗原，其功能与有丝分裂密切相关。为了进一步验证锌对BMSCs增殖活力的影响，本实验采用免疫细胞化学法检测细胞增殖标志蛋白Ki67的表达，缺锌组Ki67阳性表达率显著低于空白对照组，低浓度锌处理组Ki67阳性表达率显著高于空白对照组、缺锌组和高浓度锌处理组，这一结果与MTT结果相符合，说明适宜浓度的锌能够促进BMSCs增殖，而锌浓度增加到一定阈值，增殖能力反而下降甚至起到抑制作用。

以往研究表明BMSCs在体外条件下可以分化为神经样细胞，已经作为治疗神经系统疾病有前景的干细胞[9]。我们的研究中，与空白对照组比较，缺锌诱导组与正常诱导组GFAP和NSE阳性表达率显著升高，提示BMSCs具备向神经样细胞分化潜能。在正常诱导组与低浓度锌处理组阳性率显著高于缺锌诱导组，而且，低浓度锌处理组显著高于正常诱导组，提示在适宜锌浓度处理下能够促进BMSCs向神经样细胞分化。我们的研究结果中，GFAP和NSE在高浓度锌处理组阳性表达率低于缺锌组、正常诱导组以及低浓度锌处理组，表明锌浓度过高对BMSCs向神经样细胞分化起到抑制作用。锌是人体必须的微量元素之一，不能通过简单扩散跨越细胞膜进入细胞，需要特殊的膜蛋白转运体协助下才能进入细胞。有研究表明，器官或细胞中锌的动态平衡是由ZnT和ZIP膜蛋白介导，ZnT能够调节胞质内锌离子外流或使细胞内锌区室化，来减少细胞内锌含量。ZIP则相反，作为锌转运体，它通过调节细胞对锌的摄入或调节细胞器释放锌来增加胞浆内的锌含量[10，11]。但在我们的研究中，对于ZnT和ZIP如何调节锌含量的研究机制还不够明确，需进一步深入研究。

综上所述，一定浓度的锌能够提高BMSCs增殖活性，促进BMSCs向神经样细胞分化，但锌如何发挥调控BMSCs的分化的机制仍需进一步研究。

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基金项目：国家自然科学基金(81573067)；吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20130413023GH)；吉林省卫生计生科研计划项目

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)07-1045-04

中图分类号：Q813

文献标识码：A

(收稿日期：2016-04-15)

Effect of zinc on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells

YANJun1,WANGYong-jie1,MENGChun-yang2,etal.

(1.DepartmentofToxicology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun,130021,China;2.DepartmentofOrthopedic,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of zinc on the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural-like cells.MethodsBMSCs were isolated by adherence and cultured in vitro.MTT method was used to detect the proliferation activity of BMSCs treated with different concentration zinc in 24 h,48 h,72 h.The Ki67 expression in BMSCs administrated by different concentration zinc were detected by immunocytochemical method.The third generation BMSCs were divided into five groups,including blank control group,zinc deficiency group,normal induction group,low concentration zinc treatment group and high concentration zinc treatment.Apart from the blank control group,BMSCs in the other four groups were cultured for 5 days in differentiation induction culture medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF),then were induced to differentiate into neural-like cells in the culture medium with retinoic acid for 14 days.Cell growth morphology was observed by inverted microscope.The expression of glial fiber acidic protein (GFAP) and neuron specific enzyme (NSE) were detected by immunocytochemistry.ResultsMTT assay showed cell viability of BMSCs exposed to 200×10-7mol/L zinc were highest at different time points;immunocytochemistry results showed that Ki67-positive cells percentage of BMSCs in zinc deficiency group was lower than that in blank control group (P<0.05),Ki67-positive cells percentage of BMSCs in low zinc treatment group was significantly higher than those in the blank control group,zinc deficiency group and high zinc treatment group (P<0.05);GFAP-positive and NSE-positive percentages of BMSCs in zinc deficiency group,the normal induced group and low zinc treatment group were significantly higher than those in blank control group and high zinc treatment group (P<0.05),and GFAP-positive and NSE- positive percentages of BMSCs in normal induced group and the low zinc treatment group were significantly higher than that in zinc deficiency group (P<0.05),GFAP-positive and NSE-positive percentages of BMSCs in low zinc treatment group were significantly higher than those in normal induced group (P<0.05).ConclusionZinc can enhance the proliferation of BMSCs and promote the differentiation of BMSCs into neural-like cells in a certain concentration range.

Key words:Bone marrow mesenchymal stem cells;Zinc;proliferation;differentiation

(2014Z046)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2015533));大学生创新训练项目(2014A72312)