离子交换色谱法测定利塞膦酸钠片中的磷酸盐和亚磷酸盐

殷勤红刘小龙

（1昆明积大制药股份有限公司，云南 昆明 650106；2昆明理工大学生命科学与技术学院，650224）

离子交换色谱法测定利塞膦酸钠片中的磷酸盐和亚磷酸盐

殷勤红1，2刘小龙1

（1昆明积大制药股份有限公司，云南 昆明 650106；2昆明理工大学生命科学与技术学院，650224）

目的：在阴离子型交换柱上以邻苯二甲酸氢钾缓冲盐为流动相可同时测定利塞膦酸钠片中的磷酸盐和亚磷酸盐。方法：采用高效液相色谱法，Waters IC-Pak柱（4.6 mm×50 mm，5 μm），流动相为邻苯二甲酸氢钾缓冲盐；柱温30℃；进样量10 μL；流速0.6 mL/min；检测波长290 nm。结果：磷酸盐和亚磷酸盐的保留时间分别为7.8 min和9.8 min，该方法线性相关系数均大于0.999，精密度和准确度高，平均回收率分别为97.7% 和100.8%。结论：本方法操作简便，准确可靠，专属性强，重现性好。适用于利塞膦酸钠片中磷酸盐和亚磷酸盐的检测。

利塞膦酸钠片；磷酸盐；亚磷酸盐；离子交换色谱法

利塞膦酸钠［1-2］是第三代双膦酸盐类药物，用于妇女绝经后骨质疏松症和长期糖皮质激素治疗导致的骨质疏松症的防治，利塞膦酸钠能紧密地吸附在骨质主要成分羟磷灰石的表面，抑制破骨细胞对骨质的吸收，同时也通过干扰破骨细胞附着，诱导破骨细胞的调亡。由于在利塞膦酸钠原料合成过程中使用了亚磷酸，且其水解产物为亚磷酸盐，经空气氧化成为磷酸盐；同时作为利塞膦酸钠合成过程中产生的磷酸盐和亚磷酸盐，极易引起胃肠道等不良反应，为此在生产利塞膦酸钠片的过程中需要控制这两种磷酸盐的含量。为了严格控制本品的质量，本文采用IC-Pak为色谱柱的分析方法来检测磷酸盐和亚磷酸盐，为该药提供了一种新的可靠的分析手段。

1仪器与药品

SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪（LC-20AT型泵，SPD-20A型紫外检测器，SPD-M20A型二极管阵列检测器，SIL-20AC型自动进样器，CTO-20AC柱温箱，CBM-20Avlite系统控制器，LC solution色谱工作软件）。邻苯二甲酸氢钾（天津市化学试剂研究所，批号：20080506）、一水磷酸二氢钠（Sigma-Aldrich Co.LLC，批号：S9638-25）、五水亚磷酸钠（Meryer Chemical Technology Co.，Ltd.，批号：68927403）。利塞膦酸钠片（昆明积大制药股份有限公司，规格35 mg，批号：080101，100105，101002）。

2方法与结果

2.1色谱条件

参考美国药典（USP38-NF33）中Foscarnet Sodium［3］质控项目“Limit of phosphate and phosphite”的色谱条件，本方法选择的色谱条件为：色谱柱为Waters IC-Pak（4.6 mm×50 mm，5 μm），流动相为邻苯二甲酸氢钾缓冲盐（称取0.1 g邻苯二甲酸氢钾，用水溶解，再加入2.5 mL的1 mol/L硝酸，并用水稀释至1 000 mL），流速0.6 mL/min；进样量10 μL；柱温30℃；检测波长290 nm。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液的配制精密称取一水磷酸二氢钠适量，用水溶解并制成每1 mL含0.28 mg的磷酸二氢钠储备液。精密称取五水亚磷酸钠适量，用水溶解并制成每1 mL含0.43 mg的亚磷酸钠储备液。分别移取1 mL的磷酸二氢钠储备液和亚磷酸钠储备液至 25 mL量瓶中，用水稀释至刻度。

2.2.2供试品溶液的配制取10片，研细，精密称取适量，用水溶解并配制成每1 mL含2.4 mg的溶液（以利塞膦酸钠计）。

2.3专属性

分别取空白溶剂、辅料、对照溶液、供试品溶液、供试品加标溶液各10 μL进样，记录色谱图。结果表明，空白溶剂和辅料均不干扰测定，对照品溶液、供试品加标溶液中磷酸盐和亚磷酸盐的分离度均不小于2.0，专属性符合要求。见图1。

2.4标准曲线

精密量取磷酸二氢钠储备液0.2，1.0，1.6，2.0，

2.4，3.0 mL，分别置50 mL容量瓶中，对应加入亚磷酸钠储备液 0.2，1.0，1.6，2.0，2.4，3.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀即得10%，50%，80%，100%，120%，150%的线性溶液，照上述测定方法，精密量取上述线性溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以磷酸盐、亚磷酸盐的峰面积对其浓度进行线性回归，计算线性回归方程和相关系数r，并绘出线性图，见图2和图3。磷酸盐的典型回归曲线方程为：

A空白溶液；B空白辅料；C对照品；D供试品（101002）；E加标供试品；1磷酸盐；2亚磷酸盐图 1　磷酸盐和亚磷酸盐专属性HPLC图

Y=-1 824.2X+105.7（r=0.999 7），

亚磷酸盐的典型回归曲线方程为：

Y=-1 160.7X+44.6（r=0.999 1）。

结果显示，磷酸盐在1.14～17.08 μg/mL浓度内线性关系良好，亚磷酸盐在1.77～ 24.49 μg/mL浓度内线性关系良好。

图2　磷酸盐线性关系

图3　亚磷酸盐线性关系

2.5准确度

精密称取含量测定项下粉末250 mg，分别用50%，100%，150%的线性溶液溶解并制成每1 mL中约含2.4 mg的溶液，即得标示量分别为50%， 100%，150%的供试品加标溶液，照磷酸盐和亚磷酸盐测定方法，分别测定样品中磷酸盐和亚磷酸盐的含量，并计算出回收率。

磷酸盐和亚磷酸盐的准确度见表1和表2。磷酸盐和亚磷酸盐的平均回收率分别为97.7%和100.8%。

表1　磷酸盐回收率结果

表2　亚磷酸盐回收率结果

2.6稳定性

取对照溶液，分别于配制后室温放置0，2，4，8，16 h取样检测，测定磷酸盐、亚磷酸盐峰面积和RSD。磷酸盐和亚磷酸盐在室温放置16 h后，溶液中磷酸盐、亚磷酸盐峰面积RSD分别为0.30%，1.41%，说明溶液在室温放置16 h内稳定性良好。

2.7定量限和检测限

取对照溶液进行逐级稀释，照磷酸盐和亚磷酸盐检测方法进行测定，记录磷酸盐峰和亚磷酸盐峰信噪比约为10∶1和3∶1时的色谱图，此时所对应的浓度即为磷酸盐和亚磷酸盐的定量限和检测限。磷酸盐、亚磷酸盐的定量限分别为0.031%，0.031%，磷酸盐、亚磷酸盐的检测限分别为0.015%，0.015%。

2.8精密度

按照准确度试验中100%的供试品加标溶液，配制6份样品，精密量取上述溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。6份供试品加标溶液的磷酸盐和亚磷酸盐的RSD分别为1.7%和2.3%，表明本方法的精密度良好，符合定量分析要求。

2.9样品测定

取3批样品，照上述方法测定样品中磷酸盐和亚磷酸盐的含量，测定结果见表3。

表3　样品测定结果

3讨论

过去常用的磷酸盐测定方法，如比色法［4］、薄层色谱法［5］，需要选择合适的展开剂，还需要加显色剂，方法重现性差，难以用作定量分析；同时也有高效液相色谱测定方法［6-7］，但需利用特殊类型的电导检测器。

对流动相离子强度进行了筛选，发现邻苯二甲酸氢钾的量在0.92～ 1.07 g范围内，磷酸盐和亚磷酸盐峰峰形良好，分离度满足定量测定要求；倘若邻苯二甲酸氢钾的用量超出1.07 g，磷酸盐和亚磷酸盐峰将与其他阴离子色谱峰出现共淋洗现象并导致色谱峰重叠；倘若邻苯二甲酸氢钾的用量低于0.92 g，磷酸盐和亚磷酸盐峰之间又无法有效洗脱和分离。随着流动相中离子强度的增强或减弱，阴离子在色谱柱固定相中洗脱能力和洗脱速率也将得以增强或减弱。

采用二极管阵列检测器（PDA）对对照品溶液中的磷酸盐和亚磷酸盐进行检测并提取磷酸盐和亚磷酸盐色谱峰在200～ 400 nm波长扫描图，表明磷酸盐和亚磷酸盐色谱峰在247 nm和278 nm波长处有最大负吸收值；同时对比研究288，290，292 nm不同检测波长条件下的对照品溶液，发现磷酸盐和亚磷酸盐峰面积RSD均小于2.0%，表明 290 nm可作为磷酸盐和亚磷酸盐定量测定的检测波长。

本实验方法测定利塞膦酸钠片中的磷酸盐和亚磷酸，仅需常规的紫外检测器，具有分离效果好、检测灵敏等优点，方法简便、快速，可用于利塞膦酸钠片中的磷酸盐和亚磷酸盐的测定。

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Determination of Phosphate and Phophite in Risedronate Sodium Tablets by IE-HPLC

Yin Qinhong1，2，Liu Xiaolong1（1 Kunming Jida Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yunnan Kunming 650106，China；2 Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，650224）

Objective：To determine phosphate and phophite in risedronate sodium tablets simultaneously by anion exchange column chromatography using potassium hydrogen phthalate buffer saline as a mobile phase.Methods：Samples were determined by HPLC on the Waters IC-Pak column（4.6 mm×50 mm，5 μm）using potassium hydrogen phthalate buffer saline as a mobile phase.The column temperature was at 30℃ and the sample loading was 10 μL.The flow rate was 0.6 mL/min，while the UV detection wavelength was 290 nm.Results：The resolution time of phosphate and phophite were 7.8 and 9.8 min，while the mean recovery rates were 97.7%and 100.8%，respectively.The linear correlation coefficient of the method was more than 0.999，while precision and accuracy were high.Conclusion：The method is simple，accurate and reliable，with high specificity and reproducibility，which is suitable for the determination of phosphte and phosphite in risedronate sodium tablets.

Risedronate Sodium Tablets；Phosphte；Phosphite；IE-HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.06.004

殷勤红，男，工程师。主要从事新药开发工作。通讯作者E-mail：hawkyin2008@126.com

2016-02-16）