分泌表达苹果酸乳酸酶的大肠杆菌系统的构建

王宁宁，刘　瑞，陈福生，张秀艳*

（1.华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉430070）

分泌表达苹果酸乳酸酶的大肠杆菌系统的构建

王宁宁1，2，刘瑞1，2，陈福生1，2，张秀艳1，2*

（1.华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉430070）

苹果酸乳酸酶（简称苹乳酶）是果酒生产过程中苹果酸乳酸发酵（简称苹乳发酵）的关键酶。为了构建分泌表达苹乳酶的大肠杆菌表达系统，作者通过融合PCR将信号肽基因（487 bp）和苹乳酶基因 （1 623 bp）的编码序列连接在一起，将融合片段 （2110 bp）克隆到表达质粒pET28a（+）上并转化大肠杆菌，得到阳性克隆子。IPTG诱导阳性克隆子后可得到相对分子质量约为60 000左右的蛋白质，利用HPLC可在其发酵上清液中检测到240.7 mg/L的L-乳酸。这说明成功构建了分泌表达苹乳酶的大肠杆菌系统，该菌株的获得将为苹乳酶的研究和应用提供了技术平台。

苹果酸乳酸酶；苹乳发酵；分泌表达系统

苹果酸-乳酸发酵（简称苹乳发酵）是果酒生产过程中非常重要的发酵过程，它是在乳酸菌的作用下将酸涩的L-苹果酸转化成口感柔和的L-乳酸，并产生CO2［1］，从而得到预期的酸度，除此之外还具有增加微生物学稳定性、降低生涩味、增加香气、使果酒的口感柔和等作用［2］。在苹乳发酵过程中，由于果酒的低pH值，高SO2浓度，高酒精度等的影响而造成苹乳发酵迟缓，导致生物胺或氨基甲酸乙酯的前体物质等不良代谢产物，甚至导致苹乳发酵终止不彻底而引发生物危害［3-4］。

针对这一问题，国内外学者开展了系列研究，如向发酵液中加入苹果酸乳酸酶（MLE）［5］，或通过细胞融合构建降酸酿酒酵母［6-8］，或利用基因工程方法构建降酸酿酒酵母等［9］。但对苹果酸的转化率都不高，这可能是因为MLE不能很好地适应果酒的环境。

因此，作者在扩增MLE编码序列的基础上，构建分泌型表达MLE的大肠杆菌表达系统，为后续MLE的酶学性质研究和酶学性质改造奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒E.coli DH5α，E.coli BL21 （DE3），酒类酒球菌（Oenococcus oeni）：作者所在实验室保存；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168）：农科院惠赠；pET28a（+）：作者所在实验室保存。

1.1.3培养基E.coli DH5α，E.coli BL21（DE3）和枯草芽孢杆菌的保存和培养用LB培养基；酒类酒球菌用ATB培养基；大肠杆菌阳性转化子用LB培养基或含1%L-苹果酸的M9培养基培养。

1.2方法

1.2.1酒类酒球菌基因组DNA的提取，大肠杆菌质粒DNA的提取参照文献［10］。

1.2.2PCR反应条件

1）苹乳酶基因的PCR扩增：根据已报道的酒类酒球菌中苹乳酶基因序列设计引物，引入EcoR I和Xho I酶切位点，上游引物 F（mle）：5'-CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGT-3'，下游引物R（mle）：5'-TCGCTCGAGTTAGTATTTCGG CT CCCAC-3'。PCR反应程序：94℃预变性4 min，94 ℃30 s，58℃1.5 min，35个循环（两步PCR反应）；

2）信号肽基因的PCR扩增：根据NCBI发布的Bacillus subtilis 168菌株β-葡聚糖酶基因序列设计引物，引入NcolⅠ酶切位点和与苹乳酶基因反向互补的碱基，上游引物F（sig）：5'-CATGCCATGGAA ACCTACATTGAGCGGGGAG-3'，下游引物R（sig）：5'-TACTTACTGGATCTGTCATTTGAGCTGAGGCAG TAGCAGTG-3'。PCR反应程序：94℃预变性5 min、94℃30 s、55℃30 s、72℃40 s，30个循环，72℃延伸10 min；

3）信号肽基因和苹乳酶基因的融合PCR：重新设计苹乳酶基因的上游引物F（mle2）：5'-ATGACAGATCCAGTAAGT-3'，下游引物仍为R（mle）：5'-TCGCTCGAGTTAGTATTTCGGCTCCCAC-3'，5'端带有EcoR I酶切位点CTCGAG和保护碱基TCG。融合PCR体系中信号肽基因和苹乳酶 （摩尔比）以1∶1加入25 μL反应体系中，反应体系其它成分组成同前。融合PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃30 s，58℃5 min，72℃ 2 min 30 s，15个循环，72℃延伸10 min。

1.2.3DNA的酶切、连接和测序酶切和连接按照产品说明书进行，测序工作由南京金斯瑞公司完成。

《诗·小雅·常棣》：“死丧之威，兄弟孔怀。”《笺》：“死丧可畏怖之事，维兄弟之亲甚相思念。”本为极其思念之意，后以孔怀指兄弟。《三国志·魏·管辂传》“明年二月卒，年四十八”《注》引管辂弟辰作《辂别传叙》：“辰不以闇浅，得因孔怀之亲，数与辂有所谘论。”北齐颜之推《颜氏家训·文章》：“陆机《与长沙顾母书》，述从祖弟士璜死，乃言‘痛心拔脑，有如孔怀’。心既痛矣，即为甚思，何故言有如也？观其此意，当谓亲兄弟为孔怀。 ”〔2〕8

1.2.4大肠杆菌的转化和质粒提取参照文献［10］进行。

1.2.5大肠杆菌阳性转化子的诱导表达将活化好的阳性转化子以体积分数1%接种于5 mL LB液体培养基中（含50 mg/L卡那霉素），37℃、200 r/min下培养 2～3 h（OD600 nm=0.6～0.9），加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG诱导4 h。取1 mL培养液，12 000 r/min离心15 min后去上清液；加50 μL 1×SDS上样缓冲液到沉淀中，沸水浴10 min，离心后的上清液可用于SDS-PAGE检测。

1.2.6阳性转化子产L-乳酸能力的分析阳性转化子经IPTG诱导后，在培养上清中加入终浓度为1 mmol/L NAD，0.5 mmol/L Mn2+，37℃反应 1 h，取100 μL反应液进行HPLC分析。高效液相检测条件：固定相为C18-EP柱；流动相为 20 mmol/L KH2PO4（pH 2.5）；流速为0.8 mL/min；检测波长为210 nm。为了测试酶法分析乳酸方法在检测发酵液中苹乳酶活性的可行性，我们同时用乳酸检测试剂盒检测了反应液中乳酸的含量，检测方法参见Labarre等（1996）的方法。

2结果与分析

2.1分泌型表达MLE的大肠杆菌表达系统构建

通过融合PCR将苹乳酶基因编码序列 （1 623 bp）和信号肽序列（487 bp）连接，得到大小为2 110 bp的片段，见图1。用EcoR I和Ncol I限制酶切合片段和载体pET28a（+），通过T4连接酶将酶切片段连接以构建重组载体pET28a（+）-mle，具体过程见图2。将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞，并涂在含50 mg/L的卡那霉素的LB平板上，筛选阳性转化子。

图1　　信号肽和mle编码序列及其融合片段Fig.1　Signal peptide and mle encoding sequence and the fused fragment

图2　　重组质粒pET28a（+）-mle构建流程图Fig.2　Flowchart for pET28a（+）-mle construction

2.2阳性转化子的PCR和双酶切验证

对筛选到的阳性转化子进行PCR和双酶切验证，以含有pET28a（+）的菌株作为对照菌株。以F （sig）和R（mle）为引物对转化子进行PCR验证。结果显示，在含有重组载体菌株中扩增出大小为2 110 bp的片段，而对照菌株则未扩增出片段，见图3。用EcoR I和Ncol I限制酶对重组载体进行双酶切验证，结果显示：重组载体经双酶切后得到了大小为5 400 bp和2 110 bp的片段，而未经切割的载体仍为7 369 bp，表明已经得到了含有重组载体pET28a（+）-mle的阳性克隆子。

图3　重组质粒pET28a（+）-mle的PCR和双酶切验证Fig.3　Verification of recombinant pET28a（+）-mle by PCR and enzyme digestion

2.3含重组载体pET28a（+）-mle的大肠杆菌的诱导表达

按照方法1.2.5对阳性克隆子进行诱导表达，并进行SDS-PAGE。以含有pET28a（+）的菌株作为对照。结果见图4。可以看出，含有pET28a（+）-mle 的E.coli BL21在经过IPTG诱导后得到相对分子质量大小约为60 000蛋白质，与预期大小相符合；而在未经诱导的含有pET28a（+）-mle的E.coli BL21，在经IPTG诱导的含有pET28a（+）的E.coli BL21和E.coli BL21中未发现该蛋白质的表达。这说明分泌型表达苹乳酶的重组表达系统已经成功构建。

图4　阳性转化子全蛋白质的SDS-PAGE图Fig.4　SDS-PAGE photogram of whole protein from transformants

2.4阳性转化子培养上清中产生L-乳酸的分析

根据方法1.2.6用HPLC对阳性转化子发酵上清液中的乳酸进行分析，以 E.coli BL21和含pET28a（+）的E.coli BL21作为对照，分析图谱见图5-8。

图5　L-乳酸标准品（200 mg/L）的HPLC图Fig.5　HPLC of L-lactic acid standard solution（200 mg/L）

图6　E.coli BL21培养上清液中L-乳酸HPLC图Fig.6　HPLC of L-lactic acid in supernatant ofE.coli BL21

图7　　含pET28a（+）E.coli BL21培养上清液的 L-乳酸HPLC图Fig.7　HPLC of L-lactic acid for supernatant of E.coli BL21 with pET28a（+）

图8　含pET28a（+）-mle E.coli BL21培养上清液的L-乳酸HPLC图Fig.8　HPLC of L-lactic acid for supernatant of E.coli BL21 with pET28a（+）-mle

由图5可以看出，L-乳酸的保留时间是4.941 min。由图6-8可以看出，野生型和含pET28a（+）的E.coli BL21，在保留时间4.9 min附近无吸收，而含pET28a（+）-mle的E.coli BL21在4.943 min处有吸收，表明经过诱导含有pET28a（+）-mle的E.coli BL21能够表达苹乳酶且能转化苹果酸为乳酸。通过外标法计算出L-乳酸质量浓度为240.7 mg/L。

同时用乳酸检测试剂盒（酶法检测原理）检测各菌株发酵上清液中L-乳酸的质量浓度，结果见表1。

表1　　乳酸试剂盒检测培养上清中L-乳酸质量浓度Table 1　L-lactic acid content detected with L-lactic acid assay kit

由表 1可以看出，野生和含 pET28a（+）的E.coli BL21的培养上清液中未检出 L-乳酸，和HPLC检测结果相一致。含pET28a（+）-mle的E.coli BL21上清液中检出L-乳酸的质量浓度为252.8 mg/L，比HPLC法检出的结果稍大，这说明含pET28a（+）-mle的E.coli BL21外分泌的MLE有活性，具有将L-苹果酸转化为L-乳酸的能力。乳酸检测试剂盒可用于苹乳酶活性的检测。

3结语

作者将来自枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶的信号肽序列与苹乳酶基因的编码序列融合并克隆入载体pET28a（+）中，成功构建了分泌型表达苹乳酶的载体。含有该载体的E.coli BL21能够成功地诱导表达苹果酸乳酸酶，表达的苹果酸乳酸酶能够转化苹果酸产生乳酸，分别用HPLC和乳酸检测试剂盒在发酵上清液中检测到240 mg/L和252.8 mg/L的乳酸。

同时作者将含有信号肽编码序列MLE插入表达载体pET22b（+）中，成功构建了重组载体pET22b （+）-mle，见图9。SDS-PAGE分析结果表明，在IPTG诱导的条件下，阳性克隆子能高效表达苹乳酶，见图10。但是其培养上清液中并没有检测到L-乳酸的存在，见图11，这说明表达的MLE没有活性，这可能是因为在pET22b（+）表达系统中，表达量虽然较高，但信号肽不能有效地引导蛋白质进入周至空间和细胞外，而在胞内的蛋白质则可能因为没有来得及正确折叠而无法发挥其活性。

图9pET22b（+）-mle的PCR和双酶切验证Fig.9　Verification ofpET22b（+）-mle by PCR and double digestion

图10 苹果酸乳酸酶的SDS-PAGE图Fig.10　SDS-PAGE analysis of MLE

图11　　含pET22b（+）-mle E.coli BL21培养上清液的L-乳酸HPLC图Fig.11　HPLC of L-lactic acid for supernatant of E.coli BL21 with pET22b（+）-mle

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Construction of Secretory Escherichia coli Expression System of Malolactic Enzyme

WANG Ningning1，2，LIU Rui1，2，CHEN Fusheng1，2，ZHANG Xiuyan1，2*
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Malolactic enzyme（MLE）is a key enzyme inmalactic fermentation（MLF）during fruit-wine producing.In order to construct the secretory Escherichia coli（E.coli）expression system of MLE.The signal peptide gene（487 bp）and the MLE gene（1 623 bp）were combined through fusion-PCR，then the fused fragment was inserted into pET28a（+）and transformed into E.coil. 60 000 protein was obtained when the positive strain was cultured and induced with IPTG.240.7 mg/L L-lactic acids could be detected in the fermentation supernatant with HPLC.All the results indicated the secretory E.coli expression system of MLE was successfully constructed.This will provide a technical platform for the research and application of MLE.

malolactic enzyme，malactic fermentation，secretory expression system

Q 78

A

1673—1689（2016）05—0498—06

2014-10-14

国家自然科学基金项目（31071588）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2662015PY068）。
*

张秀艳（1973—），女，河南南阳人，工学博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事食品生物技术方面的研究。E-mail：xiuyanzhang73@mail.hzau.edu.cn