烟草节杆菌肌酸酶的高效异源表达与应用分析

戴　俊，康　振，张琳培，陈　坚，堵国成*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

烟草节杆菌肌酸酶的高效异源表达与应用分析

戴俊1，2，康振1，2，张琳培1，2，陈坚1，2，堵国成1，2*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

肌酸酶（CRE）是临床检测血液和尿液中肌酐的关键酶之一。作者成功地从烟草节杆菌23710（Arthrobacter nicotianae 23710）中克隆了CRE基因，并实现了CRE在Escherichia coli BL21（DE3）中的表达。经过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换色谱、分子筛后得到了较纯的重组CRE，比酶活达到了20.25 U/mg。重组CRE对于螯合剂EDTA、表面活性剂（Tween20，和Triton X-100）以及常用的防腐剂NaN3有很好的耐受性。

肌酸酶；烟草节杆菌；重组酶表达；应用分析

肌酐是人体中重要的代谢产物，血液中肌酐含量一般维持在35～150滋mol/L，多余的肌酐将通过肾脏系统排到体外［1］。一旦人体肾脏功能出现问题，肌酐无法随尿液排出，血液中的肌酐含量就会随之升高，测定血液和尿液中肌酐的含量就可以出反应肾脏功能［2］。目前临床使用酶法对肌酐进行检测，酶法主要由3个酶促反应组成，其中的3种关键酶分别为肌酐酶（Creatininase，EC 3.5.2.10）、肌酸酶（Creatinase，简称为CRE，EC 3.5.3.3）以及肌氨酸氧化酶（Sarcosine oxidase，EC 1.5.3.1）［3］。

CRE作为酶法测定肌酐中的关键酶，可以将肌酸分解为肌氨酸和尿素［4］。在自然界中，很多种类的菌株可以在诱导条件下产生CRE，这些菌株包括：芽孢杆菌属（Bacillus）［5］、黄杆菌属（Flavobacterium）［3］、假 单 胞 菌 属（Pseudomonas）［6］、节 杆 菌 属（Arthrobacter）［2］、产碱杆菌属（Alcaligenes）［7］、副球菌属（Paracoccus）［8］、梭菌属（Clostridium）［9］等。相应地，针对野生菌产生的CRE也有纯化、性质分析以及评估等相关的研究［10］。智强等人成功地从筛选的A.nicotianae 02181中纯化出CRE，并进行了性质分析，结果发现，该CRE具有良好的酶学性质，然而野生菌的CRE产量很低［11］，不适合应用工业进行大规模的生产。因此，通过构建细胞工厂来生产出具有良好性质的CRE是必需的。

在本研究中，作者成功克隆了来源于A.nicotianae 23710和Pseudomonas putida KT2440 的CRE基因，随后分别构建重组菌实现了CRE的异源表达，并分析了两种重组菌的表达情况。最后对来源于A.nicotianae 23710的重组CRE进行了应用性质分析。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株和质粒A.nicotianae 23710：购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心 （CICC）；菌株E. coli JM109、E.coli BL21（DE3）、Lactobacillus reuteri CICC6124、P.putidaKT2440和 质 粒pMD19、pET20b：均为作者所在实验室保藏。

1.1.2主要试剂Primer Star DNA聚合酶、限制性内切酶、Solution I DNA连接酶、琼脂糖、感受态制备试剂盒、胶回收试剂盒：TaKaRa公司（大连）；氨苄青霉素、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、质粒提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒：上海生工生物有限公司；蛋白胨、酵母粉：Oxoid公司；标准相对分子质量蛋白质、上样蛋白质缓冲液、SDS-PAGE预制胶：LifeTechnologies公司；其它试剂均为进口分装或国产。

1.1.3主要溶液的配制

1）对-二甲氨基苯甲醛溶液：称取2 g对-二甲氨基苯甲醛，溶于100mL二甲亚砜，加入15mL盐酸。

2）肌酸溶液：称取1.492 g肌酸，溶于90 mL PBS缓冲液中并定容至100 mL，要求在使用前配置。

3）PBS缓冲液（50 mmol/L）：分别配制0.2 mol/L 的NaH2PO4和0.2 mol/L Na2HPO4母液以备用，取95mL0.2mol/LNaH2PO4，155mL0.2mol/L Na2HPO4，加入去离子水并定容至1 000 mL。

1.1.4培养基

1）LB培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10。

2）TB培养基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，K2HPO416.43，KH2PO42.32。

3）检测培养基（g/L）：酵母粉 0.1，蛋白胨 1，葡萄糖1，NaCl 5，KH2PO42，肌酸1，酚红0.012。

1.2实验方法

1.2.1重组质粒的构建根据NCBI数据库中查询到其它来源的CRE基因序列，设计引物ACRE-F、ACRE-R、PCRE-F、PCRE-R，引物序列见表1。以ACRE-F、ACRE-R为引物，A.nicotianae 23710基因组为模板进行PCR扩增；以PCRE-F、PCRE-R为引物，P.putida KT2440基因组为模板进行PCR扩增。将得到的CRE基因分别连接pMD19-T，得到质粒pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre，进行测序。用 NdeI和 XhoI分别双酶切 pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre，与同样进行双酶切的pET-20（b）进行连接，连接液转入E.coli JM109后提取质粒进行酶切验证。

表1　　引物序列Table 1　Primer sequence

1.2.2CRE的诱导表达将验证正确的质粒转入E.coli BL21（DE3）中，挑取单菌落接入20 mL LB培养基中，37℃培养12 h，转速为220 r/min。将生长好的种子液以体积分数5%接种至TB发酵培养基中，37℃进行培养。待OD600达到0.6时，接入IPTG进行诱导，并把温度降至30℃诱导10 h。

1.2.3CRE的平板检测预先在LB平板上将L.reuteri CICC6124指示菌和需要检测的菌株分别划线，待划线菌落长到一定大小，挑取指示菌单菌落于检测平板上，并将待检测菌株接种于指示菌的附近，将平板放置于30℃培养箱进行培养，观察平板上颜色变化［11］。

1.2.4CRE的活性测定在试管中加入900滋L肌酸溶液，在室温中平衡5 min后加入100滋L待测酶液，在37℃反应10 min，然后向反应体系中加入2 mL对-二甲氨基苯甲醛溶液终止反应，并置于25℃温育20 min，在435 nm处测定吸光度值，以水调零。空白管是在肌酸溶液中先加入对-二甲氨基苯甲醛，后加入待测酶液，其它步骤与测定管一致。

单位酶活定义：1 min内将肌酸水解产生 1 滋mol尿素所需要的酶量。

1.2.5CRE的纯化方法将发酵液12 000 r/min离心10 min，除去上清液，用纯水将菌体洗涤两次后加入适量的PBS缓冲液悬浮细胞。在冰浴条件下利用超声破碎仪对重组大肠杆菌进行破碎。对破碎后的悬浮液进行硫酸铵分级沉淀，取饱和度为60%～80%的沉淀部分，以PBS缓冲液溶解沉淀并透析过夜。透析后，利用微孔滤膜（0.25滋m）去除酶液中的杂质，利用AKTA蛋白纯化仪进行纯化，使用的柱子为阴离子交换柱（HiPrep 16/10 Q_XL）。上样缓冲液（A液）为50 mmol/L的PBS缓冲液，而洗脱缓冲液（B液）为加有1 mol/L NaCl的50 mmol/L的PBS缓冲液。以A液进行上样并平衡30 min，之后以B液进行线性洗脱，收集洗脱蛋白质。将有酶活的收集液用凝胶柱（HiLoad 16/60 superdex 200）进一步纯化，缓冲液为50 mmol/L的PBS缓冲液。

1.2.6化学物质对CRE影响的分析在酶液中添加一定浓度的化学物质，在0℃保持30 min，测定酶活，并与不添加任何化学物质的酶液酶活进行比较。

2结果与讨论

2.1CRE重组菌的构建

以A.nicotianae 23710和P.putida KT2440基因组为模板分别扩增cre基因，凝胶电泳见图1。在1.2 kb处都有一条DNA条带，与预期相符。对来源于A.nicotianae 23710和P.putida KT2440的CRE基因进行测序，测序结果见图2。将测序结果与之前报道的肌酸酶序列进行比对，发现A.nicotianae 23710与A.nicotianae 02181来源的CRE基因同源性为91.7%，P.putida KT2440与P.putida GB-1来源的CRE基因同源性为93.3%，而不同属来源的CRE同源性较低，A.nicotianae 23710和P.putida KT2440来源的CRE基因同源性仅为65.1%。

图1CRE基因琼脂糖凝胶电泳图Fig.1　Agarose gel electrophoresis of CRE gene

对pMD19-T/Acre和pMD19-T/Pcre双酶切，回收片段后连接到表达载体 pET20b上，并转入E.coli JM109中。经过菌落PCR初步验证得到阳性重组子，接种过夜培养后提取质粒进行酶切验证，酶切成功说明重组质粒pET20b-Acre与pET20b-Pcre构建成功。将验证正确的质粒转入E.coli BL21 （DE3）得到重组表达菌株E.coli BL21A和E.coli BL21P。

在设计引物时，在下游引物中加入了TAA终止密码子。在pET20b质粒上，Xho I酶切位点后有His-tag，如果不加入终止密码子，表达的蛋白质C-端会带有几个组氨酸。之前为了方便后续的CRE纯化，没有加终止密码子，将CRE与His-tag融合表达。虽然外源蛋白质在重组菌中表达了出来，但均没有CRE活性。这可能是因为CRE的活性位点位于肽链的C-端附近，加入了His-tag可能会影响蛋白质的二级结构，导致表达的蛋白质没有CRE酶活。

2.2重组菌的表达

2.2.1平板检测检测平板中含有肌酸，如果待检测菌产CRE，可以分解肌酸得到尿素。而L.reuteri CICC6124可以将尿素分解产生氨，使周围培养基pH升高，从而使培养基中的pH指示剂酚红改变颜色。在检测平板上分别接种如下菌株：指示菌L.reuteri CICC6124、阴性对照菌E.coli BL21（pET20）、待检测菌E.coli BL21A、E.coli BL21P，观察生长情况。平板检测结果见图3。可以发现，在E.coli BL21A、E.coli BL21P周围均有红色，且E.coli BL21A周围的显色反应比E.coli BL21P还要强烈，而E.coli BL21（pET20）周围却没有明显红色，说明重组菌E.coli BL21A和E.coli BL21P可以产CRE。

2.2.2SDS-PAGE分析和酶活检测将摇瓶发酵液1 000 r/min离心10 min，去除上清液，以PBS缓冲液悬浮细胞。在0℃下破碎细胞，破碎完全后离心，取上清液分别进行SDS-PAGE分析和酶活检测。SDS-PAGE分析结果见图4。在相应大小处重组菌上清液均有明显条带，而E.coli BL21（pET20）没有明显条带，说明CRE在重组菌中实现了表达，且表达量较高。

图2　　来源于A.nicotianae 23710和P.putida KT2440的CRE基因序列Fig.2　CRE genes from A.nicotianae 23710 and P.putida KT2440

图3CRE酶活平板检测Fig.3　Determination　oftheCRE　activitywith　an indicator plate

酶活检测测得原始菌A.nicotianae 23710的酶活为190.19 U/g，P.putida KT2440酶活为54.92 U/g，而重组菌 E.coli BL21A酶活为 1 834.04 U/g，E.coli BL21P酶活为1 380.92 U/g。可以发现重组菌酶活要远高于原始菌酶活，而两种重组菌相比之下，E.coliBL21A比E.coliBL21P的酶活高出32.8%。

图4　　重组CRE SDS-Pisis of recombinant CRE

2.3重组CRE的纯化

CRE的整个纯化过程是由硫酸铵沉淀、阴离子柱纯化、分子筛构成的。由于细胞内杂蛋白质含量比较多，不利于目的蛋白质与阴离子柱的结合，需要先去除一部分杂质。硫酸铵沉淀作为一种温和的不易使蛋白质变性的纯化方法被广泛应用，所以在使用阴离子柱纯化之前，选择硫酸铵沉淀以去除部分杂蛋白质并浓缩目的蛋白质。进行硫酸铵分级沉淀时，发现重组CRE主要在硫酸铵浓度为60%～80%条件下析出。

CRE的理论等电点（PI）在5.0左右，在pH为7.0的条件下带负电荷，因此可以选择阴离子交换色谱作为纯化的第二步。发现在15%～20%B的洗脱条件下，出现了一个峰形很好的洗脱峰，经酶活检测确实为CRE的洗脱峰。

此纯化方法操作方便，且操作步骤较少，可以快速制备纯化样品（见图5），以便对重组CRE的进一步分析。

对纯化的两种重组CRE进行比酶活测定，结果E.coli BL21A的CRE比酶活为20.25 U/mg，而E.coli BL21P的CRE比酶活为9.0 U/mg。E.coli BL21A的CRE比酶活相比之下高很多，且E.coli BL21A的产酶量较高，所以将E.coli BL21A作为后期的主要研究对象。

图5重组CRE纯化过程SDS-PAGE分析Fig.5　SDS-PAGE analysis of the purification process of the recombinant CRE

2.4重组CRE的应用分析

在实际应用中，CRE需要满足一些条件。首先，CRE的最适温度在35～45℃之间，最适pH在7.0～9.0之间。其次因为在制备酶试剂盒时，需要在其中加入一定量的NaN3作为防腐剂，所以要求CRE能够在一定浓度的NaN3下保持酶活。最后就是CRE的纯度要求，保证干扰应用的有害杂酶——过氧化氢酶在2%以下。根据以上在实际应用中的CRE的要求对E.coli BL21A所产的重组CRE进行应用分析。

2.4.1温度、pH对重组CRE的影响考察了温度、pH对重组CRE的影响，结果与来源于A.nicotianae 02181的CRE基本一致，最适反应温度为37℃，最适反应pH为7.5［12］。

2.4.2化学物质对重组CRE的影响分析了部分化学物质对重组CRE的影响，结果见表2。首先分析了NaN3对CRE的影响，NaN3能够抑制细胞色素氧化酶的活力从而抑制细菌的生长，在CRE的应用过程中作为防腐剂存在。分别设置了3种不同浓度的NaN3进行分析，结果发现NaN3对CRE没有显著影响。之后又分析了几种工业中常用的表面活性剂和螯合剂对CRE的影响，发现SDS能够使CRE完全失活，而螯合剂EDTA和其它类型的表面活性剂 （Tween20和Triton X-100）对CRE没有抑制作用。

表2　　不同化学物质对CRE的影响Table 2　Effect of chemicals on CRE activity

2.4.2重组CRE的纯度检测对重组CRE进行纯化后测定其中过氧化氢酶酶活，结果发现纯化的重组CRE中检测不到过氧化氢酶活性，满足应用要求。

综上，CRE的最适温度为37℃，最适pH为7.5，能够耐受NaN3，且纯化的CRE中不含过氧化氢酶，因此满足实际应用。

3结语

CRE作为酶法测定肌酐方法中的关键酶，在临床检测肾脏功能中起着重要作用。作者成功克隆来源于A.nicotianae 23710的CRE基因，并构建了重组表达菌E.coli BL21A。通过对重组菌E.coli BL21A进行诱导表达，发现重组菌酶活达到1 834.04 U/g，与原始菌的酶活190.19 U/g相比，提高了9.6倍之多。此外还对重组CRE进行了纯化和性质分析，所采用的纯化方法简单有效，可以快速得到较纯CRE进行分析。重组CRE的最适反应温度为37℃，最适反应pH为7.5，在常用防腐剂NaN3的作用下也不会影响酶活。

本研究实现了CRE的高效表达，为降低肌酸水解酶的生产成本和扩大应用范围奠定基础。

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Expression and Application Analysis of Creatinase from Arthrobacter nicotianae

DAI Jun1，2，KANG Zhen1，2，ZHANG Linpei1，2，CHEN Jian1，2，DU Guocheng1，2*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Creatine amidinohydrolase（CRE）is one of the key enzymes for clinical determination of creatinine in serum and urine.In this study，the gene encoding for CRE was successfully amplified from Arthrobacter nicotianae 23710 and functionally overexpressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The recombinant CRE was purified through a series of operation including ammonium sulfate precipitation，anion exchange chromatography and gel filtration chromatography.The specific activity of the purified enzyme reached 20.25 U/mg.The recombinant enzyme shows excellent resistance to the chelating agent EDTA，the surfactants（Tween20 and Triton X-100）and the common preservative NaN3.

creatinase，Arthrobacter nicotianae，expression，application analysis

Q 814

A

1673—1689（2016）05—0465—06

2014-09-30

国家863计划项目（2011AA100905）；长江学者和创新团队发展计划项目（IRT1135）；国家博士后基金项目（2013M540414）；江苏省自然科学基金项目（BK20141107）；江苏省博士后基金项目（1301010B）。
*

堵国成（1965—），男，江苏常州人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事代谢工程、发酵过程优化与控制等领域的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn