表皮生长因子受体和多药耐药蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与化学药物治疗疗效的相关性

王晓敏，任力，岳颖，郑吉春

（1.潍坊医学院附属医院 病理科，山东 潍坊 261000；2.中国人民解放军空军总医院 病理科，北京 100142）

表皮生长因子受体和多药耐药蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与化学药物治疗疗效的相关性

王晓敏1，任力2，岳颖2，郑吉春2

（1.潍坊医学院附属医院 病理科，山东 潍坊 261000；2.中国人民解放军空军总医院 病理科，北京 100142）

目的探讨表皮生长因子受体（EG FR）与多药耐药蛋白（M D R）在非小细胞肺癌中的表达及与化学药物治疗（以下简称化疗）疗效的相关性。方法采用免疫组织化学二步法检测95例非小细胞肺癌（N SC LC）组织和15例正常肺组织中EG FR与肺耐药蛋白（LR P）、P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（M R P）及谷光甘肽转移酶（G ST-π）的表达。结果95例N SC LC中，EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π在N SC LC组织中的阳性表达率分别为50.53%、60.00%、40.00%、41.05%和55.79%。EG FR表达在有无吸烟史、不同病理类型（鳞癌vs腺癌）、不同TN M分期及有无淋巴结转移的N SC LC患者间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。LR P和M R P在腺癌中的阳性表达率高于鳞癌（P＜0.05），M R P在高分化癌的表达阳性率低于中、低分化（P＜0.05）。M R P与LR P、P-gp与G ST-π的表达呈正相关（r=0.341，P=0.001；r=0.213，P=0.038），EG FR与LR P、P-gp、M R P、G ST-π的表达无关（P＞0.05）。EG FR阳性表达的化疗有效率为37.5%，低于EG FR阴性表达的化疗有效率（66.0%）（P＜0.05）。结论N SC LC组织中EG FR与多药耐药蛋白常阳性表达，形成M D R的4种蛋白相互联系，可能对耐药的形成起协同作用，EG FR可以作为评价N SC LC化疗疗效的客观指标。

非小细胞肺癌；免疫组织化学；表皮生长因子受体；多药耐药蛋白

非小细胞肺癌（non-sm al l cel l l ung cancer，NSCLC）占肺癌的85%，是常见的恶性肿瘤之一，发病率、死亡率逐年上升。化学药物治疗（以下简称化疗）是中晚期肺癌综合治疗的主要手段之一，然而多药耐药（m ul t i drug resi st ance，M DR）的产生明显降低化疗效果，是化疗失败的主要因素。M DR是一个复杂多变的过程，由多因素通过多途径来实现，较常见的多药耐药因素包括：肺耐药蛋白（l ung resi st ance prot ei n，LRP）、P-糖蛋白（P-gl ycoprot ei n，P-gp）、多药耐药相关蛋白（m ul t i-drug resi st ance associ at ed prot ei n，M RP） 和谷光甘肽转移酶（gl ut at hi one S-t ransf erase-π，GST-π）等。表皮生长因子受体（epi derm al growt h f act or recept or，EGFR）是细胞增殖和信号传导的受体，异常活化的EGFR与配体结合，调节肿瘤细胞的增殖、分化、放化疗敏感性、抗凋亡等。本实验通过免疫组织化学（EnVi si on）法检测95例NSCLC组织和15例正常肺组织中EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π的表达，研究其相互作用及与化疗疗效的相关性，初步探讨NSCLC多药耐药的发生机制。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集空军总医院2009年10月-2012年3月纤维支气管镜活检或外科手术切除的NSCLC组织标本95例。其中，男性71例，女性24例；年龄26～80岁，平均（62±1）岁，有吸烟史的患者36例；鳞癌35例，腺癌60例；低分化癌27例，中、高分化癌68例；正电子发射计算机断层显像（posi t ron em i ssi oncom put ed t om ography，PET-CT）检查：纵隔淋巴结转移53例，无转移42例；按照国际抗癌联盟（Uni on Int ernat i onal Agai nst Cancer，UICC）2009年肺癌分期标准分期，Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ55例。所有活检或手术患者实验前未接受任何抗肿瘤治疗，实验过程中接受＞3个疗程含铂化疗方案，根据世界卫生组织标准判定疗效，达完全缓解或部分缓解为有效，稳定或进展为无效。取远离肿瘤的正常肺组织15例为对照组。EGFR鼠抗人单克隆抗体、LRP鼠抗人单克隆抗体、M RP鼠抗人单克隆抗体、P-gp鼠抗人单克隆抗体及GST-π鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉生物科技有限公司。

1.2方法

经10%甲醛固定的NSCLC组织制备成蜡块，4μm常规切片，置于特制的防脱载玻片上，En Vi si on法检测肿瘤组织中EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π表达。60℃烘干1 h，常规脱蜡、水化组织切片。经柠檬酸修复液修复抗原后切片，水洗、蒸馏水冲洗各1次，2 m i n/次，磷酸盐缓冲溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）冲洗3次，2 m i n/次；放入3%过氧化氢溶液中10 m i n，以灭活内源性过氧化氢酶，水洗、蒸馏水洗各2 m i n；滴加第一抗体，置于湿盒内，恒温箱37℃孵育45 m i n后水洗、蒸馏水冲洗各1次，2 m i n/次，PBS液冲洗3次，2 m i n/次；En Vi si onTM孵育30 m i n，水洗、蒸馏水洗各2 m i n，PBS冲洗片3次，3 m i n/次。二氨基联苯胺（Di am i nobenzi di ne，DAB）显色3～5 m i n，苏木素对比复染，中性树脂封固。以同一条件下染色的阳性颗粒作阳性对照组，用PBS代替一抗作阴性对照组。

1.3结果判读

阳性为细胞出现棕黄色颗粒，阴性为无显色。EGFR、M RP阳性着色在细胞膜和/或细胞浆，P-gp阳性着色在细胞膜，LRP阳性着色在细胞浆，GST-π着色在细胞核和/或细胞浆。根据其染色程度及细胞数量进行染色评分判读，阳性细胞评分法：阴性为0分，阳性细胞比例＜25%为1分，阳性细胞比例25%～50% 为2分，阳性细胞比例51%～75%为3分，阳性细胞比例＞75%为4分。细胞染色程度评分法：肿瘤细胞不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。上述两项之和即为肿瘤细胞的染色评分，总分0分为阴性（-），1、2分为弱阳性（+），3～6分为阳性（++），7～12分为强阳性（+++）［1］。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，用χ2检验及Spearm an秩和相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π的表达

95例NSCLC患者中，EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π在 NSCLC组织中的阳性表达率分别为50.53%（48/95）、60.00%（57/95）、40.00%（38/95）、41.05%（39/95）和55.79%（53/95），明显高于正常肺组织 6.25%（1/15）、20.00%（3/15）、13.33%（2/15）、0.00（0/15）和13.33%（2/15）（P＜0.05）。见图1～8和表1。

图1　正常肺组织苏木精-伊红染色 （×200）

图2　N SC LC苏木精-伊红染色 （×200）

图3　N SC LC免疫组织化学染色阴性对照 （×200）

图4　EG FR免疫组织化学染色表达于N SC LC的细胞浆和细胞膜 （×400）

图5　P-gp免疫组织化学染色表达于N SC LC的细胞膜（×400）

图6　M R P免疫组织化学染色表达于N SC LC的细胞膜和细胞浆 （×400）

图7　G ST-π免疫组织化学染色表达于N SC LC的细胞浆和细胞核 （×400）

图8　LR P免疫组织化学染色表达于N SC LC的细胞浆（×400）

2.2EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表达与临床病理因素的相关性

EGFR阳性表达率比较，吸烟、腺癌和淋巴结转移的患者高于未吸烟、鳞癌和无淋巴结转移的患者（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ期患者明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.05）；而EGFR阳性表达率与患者性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤分化程度等无关。LRP和M RP在腺癌中的阳性表达率高于鳞癌（P＜0.05）。不同分化程度NSCLC患者的M RP表达比较，差异有统计学意义，高分化癌患者的阳性率低于中、低分化（P＜0.05）。女性患者的GST-π阳性表达率低于男性患者，而与患者年龄、是否吸烟、肿瘤病理类型、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤分化程度等无关。见表2。

表1　两组患者EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π的表达比较　例

表2　临床病理因素与EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表达的相关性　例

2.3EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表达在N SC LC肿瘤组织中的相关性

Spearm an秩和相关性分析显示，NSCLC组织中EGFR与LRP、P-gp、M RP、GST-π的表达无关（P＞0.05）；M RP与LRP的表达呈正相关（r=0.341，P= 0.001），P-gp与GST-π的表达呈正相关（r=0.213，P= 0.038）。

2.4EG FR及多药耐药蛋白表达与N SC LC临床化疗疗效的相关性

NSCLC患者均接受＞3个疗程的含铂化疗方案，有效为率51.6%（49/95）。所有患者有完整的随访资料，生存期为接受化疗之日起至患者死亡或失访日。中位随访时间为33个月，其中死亡47例。EGFR阳性表达的化疗有效率为37.5%（18/48），EGFR阴性表达的化疗有效率为66.0%（31/47），经χ2检验，差异有统计学意义（P=0.006），EGFR过度表达的化疗有效率低于EGFR阴性表达的化疗有效率。在本研究中，P-gp阴性表达的化疗有效率为52.6%，P-gp阳性表达的化疗有效率为50.0%，经χ2检验，差异无统计学意义（P=0.801）；LRP、M RP及GST-π阳性表达患者的化疗有效率低于3者均阴性的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3　EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表达与N SC LC临床化疗疗效的相关性

3　讨论

NSCLC化疗失败的重要原因是肿瘤对药物产生多药耐药，其产生与多种因素有关，包括多药耐药基因及编码的糖蛋白、M RP、LRP、GST-π、细胞凋亡抑制、DNA损伤修复功能等，可见肿瘤的多药耐药机制很复杂，是多因素共同参与的过程。EGFR参与调节肿瘤细胞的增殖、分化、抗放化疗、抗凋亡等，与NSCLC化疗疗效及预后密切相关。

EGFR是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，一旦被激活，可使肿瘤细胞内发生酪氨酸蛋白激酶活化和受体自身磷酸化，促进肿瘤的发生、发展和转移。EGFR在肺癌中的分布和表达已经明确，许多学者用免疫组织化学法对EGFR在肺癌中的分布和表达进行研究并证实，在正常肺组织中EGFR仅表达5%～10%；在肺癌中，小细胞肺癌无EGFR阳性表达，NSCLC阳性表达的发生率为53.1%～69.7%［2-3］。本研究NSCLC肿瘤组织中EGFR阳性表达率为50.53%，明显高于对照组的阳性表达率。王瑞娟等［4］发现，EGFR在NSCLC中的阳性表达率为64.4%，癌旁组织未见表达，与TNM分期及淋巴结转移相关。Sel vaggi等［5］研究发现，NSCLC中EGFR的阳性表达率在Ⅲ期肺癌中最高，与其组织类型无关。本研究中Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者的EGFR阳性表达高于Ⅰ、Ⅱ期患者，有淋巴结转移的EGFR表达高于无淋巴结转移，进一步提示EGFR参与NSCLC的发生、发展及转移。EGFR在调节正常细胞的生长和分化中起重要作用，而其在包括NSCLC在内的许多肿瘤组织中过度表达，与预后不良、生存期缩短及存在耐药性相关。研究发现，在NSCLC患者中，特异性EGFR单克隆抗体与铂类联合应用较单用铂类化疗的有效率从29%升高到53%。对铂类产生耐药的NSCLC应用特异性EGFR单克隆抗体后，部分患者对铂类的敏感性得以恢复，EGFR过表达能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［6］。本研究结果进一步证实，EGFR过表达的NSCLC化疗疗效明显降低，部分患者虽然EGFR阴性，但是化疗效果不佳，说明EGFR与肿瘤及化疗药物的耐药性存在一定联系，而肿瘤的耐药是多种耐药因素参与，以及不同耐药机制共同影响的结果。

M DR是指使用抗肿瘤药物及未用药物治疗的恶性肿瘤，通过不同作用机制对不同化疗药物产生耐药性，包括原发性和获得性，目前对肺癌多药耐药研究比较成熟的有 LRP、P-gp、M RP、GST-π 及TopoⅡ等。LRP是最先在肺癌中发现的耐药蛋白，是一种非耗能型转运蛋白。研究证实，LRP将化疗药物储存入胞质囊泡，使药物很难进入细胞核发挥作用，并以胞吐的形式将药物从细胞中排出，从而产生耐药［7］。M RP是谷胱甘肽共轭物转运泵，与谷胱甘肽共同作用起药物泵作用，还可以通过改变细胞内pH值来改变细胞内药物分布，并逆浓度梯度降低细胞内药物浓度，最终达到耐药的目的［8］。在本研究中，95 例NSCLC患者肿瘤组织的EGFR、LRP、P-gp、M RP 及GST-π阳性表达率明显高于正常肺组织，差异有统计学意义，与国内大量文献报道基本一致［9-12］。LRP 与M RP在不同类型肺癌中的表达不同。本研究发现，95例NSCLC患者中，LRP与M RP在腺癌中的阳性表达率高于鳞癌（P＜0.05），与临床上腺癌对化疗更易存在耐药性，鳞癌相对对化疗更敏感相符。此外，不同分化程度的NSCLC患者的M RP表达比较，差异有统计学意义，高分化癌的阳性率低于中、低分化（P＜0.05），该现象未见报道。P-gp是多药耐药基因M DR1编码的膜糖蛋白，是一种耗能型药物泵，能将进入细胞的亲脂性化疗药物泵出细胞外，从而降低化疗药的疗效［13］。GST有3种同工酶，分别是GST-α、GST-μ和GST-π，其中GST-π是肿瘤细胞中最常见的耐药蛋白，既能提高细胞的解毒、抗氧化能力从而降低恶性肿瘤发生的几率，又能增强肿瘤细胞对化疗药物的代谢及转运能力，使细胞产生耐药［14］。本研究中，腺癌与鳞癌的P-gp、GST-π表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究还发现，M RP与LRP的表达呈正相关（r=0.341，P=0.001），P-gp与GST-π的表达呈正相关（r=0.213，P=0.038），说明参与形成M DR的4种蛋白并非独立因素，而是相互联系，可能对多药耐药的形成起协同作用，与一些研究结果大致相同［15］。

在本研究中，95例NSCLC患者肿瘤组织的EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π阳性表达率分别为50.53%（48/95）、60.00%（57/95）、40.00%（38/95）、41.05%（39/95）和55.79%（53/95），提示EGFR及4种多药耐药蛋白在NSCLC中过度表达，导致肿瘤的耐药。EGFR与4种多药耐药蛋白在NSCLC中的表达无相关，EGFR蛋白过度表达的化疗有效率为37.5%（18/48）明显低于EGFR阴性的有效率66.0% （31/47），差异有统计学意义，部分患者虽然EGFR阴性，但是化疗效果不佳；LRP、P-gp、M RP及GST-π一种或多种表达的患者化疗有效率低于4者均阴性的患者，由此可见，多药耐药蛋白是抗肿瘤失败的重要原因之一。以上表明影响肿瘤耐药机制的多因素性，说明EGFR可以作为评价NSCLC化疗疗效的独立指标，而且EGFR与多药耐药蛋白分别是导致肿瘤耐药形成的独立因素，因此联合检测多个耐药相关抗体，能够客观反映肿瘤的耐药，预测肿瘤化疗疗效及预后，为临床制定联合化疗方案，提高疗效提供依据。

［1］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症志，1996，6（4）:229-231.

［2］Chandri ka J，Pi yat hi l ak E，Andra R，et al.Di f f erent i al expressi on of growt h f act ors i n squam ous cel l carci nom a and precancerous l esi ons of t he l ung［J］.Cl i n Cancer Res，2002，8（3）:734-744.

［3］Jeon YK，Sung SW，Chung JH，et al.Cl i ni copat hol ogi c f eat ures and prognost i c i m pl i cat i ons of epi derm al growt h f act or recept or （EGFR）gene copy num ber and prot ei n expressi on i n non-sm al l cel l l ung cancer［J］.Lung Cancer，2006，54（3）:387-398.

［4］W ang RJ，Zhang JZ，W ang P，et al.Expressi on of ERand EGFRi n non-sm al l cel l l ung cancer and i t s si gni f i cance［J］. Journal of Oncol ogy，2010，16（8）:620-623.

［5］Sel vaggi G，Novel l o S，Torri V，et al.Epi derm al growt h f act or recept or overexpressi on correl at es wi t h a poor prognosi s i n compl et el y resect ed non-sm al l-cel l l ung cancer［J］.Ann Oncol，2004，15（1）:28-32.

［6］Govi ndan R.Cet uxi m ab i n advanced non-sm al l cel l l ung cancer［J］. Cl i n Cancer Res，2004，10（12）:4241-4244.

［7］Scheper RJ，Broxt erm an H J，Schef f cr GL，et al.Overexpressi on of a M（r）1110000 Vesi cul ar prot ei n i n non-P-gl ycoprot ei n m edi ated m ul t i drug resi st ance［J］.Cancer Res，1993，53（7）:1475-1479.

［8］M i st ry P，St ewart AJ，Dangerf i el d W，et al.In vi t ro and i n vi vo charact eri zat i on of XR11576，abnovel，oral l y act i ve，dual i nhi bi t or of t opoi som eraseⅠ andⅡ［J］.Ant i cancer Drugs，2002，13（1）:15-28.

［9］谢红旗，徐显辉，柯明耀，等.多药耐药相关蛋白基因在肺癌组织中的表达及意义［J］.实用癌症杂志，2010，25（5）:150-152.

［10］翟展艺，蒋军广，翟建霞，等.PTEN、M RP在非小细胞肺癌组织中的表达及生物学意义［J］.中国老年学杂志，2011，5（31）:1732-1733.

［11］Guo W F.Expressi on and si gni f i cance of caspase-3 GST pgp i n non-sm al l cel l l ung cancer［J］.Lung Cancer，2010，15（4）:503-505.

［12］Zhao M J，M a L，W ang Q，et al.M et a-anal ysi s on t he expressi on and survi val of ci spl at i n resi st ance gene M DR1，M RP，LRP，GST-π i n non-sm al l cel l l ung cancer［J］.M odern Oncology，2012，20（8）:1596-1600.

［13］Daschner PJ，Ci ol i no H P，Pl ouzek CA，et al.Increased AP21 act i vi t y i n drug resi st ant hum an breast cancer M CF27 cel l s［J］. Breast Cancer Res Treat，1999，5（3）:229-240.

［14］Dani el V.Gl ut at hi one-S-t ransf erases:gene st ruct ure and regul at i on of expressi on［J］.Cri t Rev Bi ochem M ol Bi ol，1993，28（3）: 173-270.

［15］Rybarova S，H aj dukova M，H odorova I，et al.Expressi on of t he m ul t i drug resi st ance rel at ed prot ei n（LRP）i n hum an l ung cancer［J］. Neopl asm a，2004，51:169-174.

（申海菊编辑）

Expressions of EGFR and MRPs in NSCLC and their correlations with effect of chemotherapy

Xiao-min Wang1，Li Ren2，Ying Yue2，Ji-chun Zheng2
（1.Department of Pathology，the Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261000，China；2.Department of Pathology，General Hospital of PLA Air Force，Beijing 100142，China）

Objective To investigate the expressions of epidermal growth factor receptor（EGFR）and multidrug resistance-associated protein（MRP），and their relationships with efficacy of chemotherapy in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods Immunohistochemistry（EnVision method）was used to detect the expressions of EGFR，lung resistance protein（LRP），P-glycoprotein（P-gp），MRP and glutathione S-transferase π （GST-π）in NSCLC tissues of 95 patients and 15 normal lung samples.Results The positive-expression rates of EGFR，LRP，P-gp，MRP and GST-π in the NSCLC were 50.53%，60.00%，40.00%，41.05%and 55.79% respectively.EGFR in the NSCLC tissues was significantly correlated with the history of smoking，pathological types of cancer（squamous cell carcinoma vs adenocarcinoma），presence of lymph node metastasis and TNM stages（P＜0.05）.The positive-expression rates of LRP and MRP in the adenocarcinomas were higher than those in the squamous cell carcinomas（P＜0.05），and the expression rate of MRP in the well-differentiated carcinomas was higher than that in the medium-and poorly-differentiated carcinomas（P＜0.05）.There were positive correlations between the expressions of MRP and LRP，P-gp and GST-π in the NSCLC（r=0.341，P=0.001；r=0.213，P=0.038）.EGFR had no correlation with LRP，P-gp，MRP or GST-π（P＞0.05）.The chemotherapy efficiency for the EGFR-negative NSCLC was 66.0%，which was significantly higher than that for the EGFR-positive NSCLC（37.5%，P＜0.05）.Conclusions EGFR and MRP are over-expressed in NSCLC tissues. Multidrug resistance proteins have synergistic effects on drug resistance.EGFR could be used to objectively predict chemotherapy effect and prognosis of NSCLC.

non-small cell lung cancer；immunohistochemistry；epidermal growth factor receptor；multidrug resistance protein

R 734.2

A

1005-8982（2016）05-0053-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.011

2013-09-18