乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂干预对慢性不可预知应激大鼠模型抗抑郁作用及机制的研究

刘晓萌，张　荣，董世芬，程工倪，畅洪昇，孙建宁

(1.北京中医药大学中药学院，北京　100102；2.中国食品药品检定研究院 国家药物安全评价监测中心，北京　100176)

L. on monoamine neurotransmitters concentration in hippocampus in CUS ±s)



乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂干预对慢性不可预知应激大鼠模型抗抑郁作用及机制的研究

刘晓萌1,2，张荣1，董世芬1，程工倪1，畅洪昇1，孙建宁1

(1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.中国食品药品检定研究院 国家药物安全评价监测中心，北京100176)

目的观察乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性不可预知应激大鼠行为学、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能以及海马组织单胺类神经递质含量的影响。方法选取SD大鼠72只，随机分为正常对照组、应激模型组、氟西汀组、乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂(高、中、低剂量)组，给药28 d，实验结束时对各组大鼠进行糖水消耗实验、Morris水迷宫实验监测，采用放免法检测血清皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的浓度，高效液相-电化学法检测海马中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)以及多巴胺(DA)的含量。结果与正常对照组相比，模型组大鼠造模4周后，糖水偏嗜度明显降低，Morris水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期延长、在目标象限的时间及总路程减少(P< 0.05)；血液指标显示，模型组大鼠血清中的ACTH、CORT、CRH含量明显升高，海马组织单胺神经递质5-HT、NE和DA的含量明显降低(P< 0.05)。与模型组相比，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂490 mg/kg，245 mg/kg剂量组可显著升高模型组大鼠糖水偏嗜度，缩短大鼠逃避潜伏期，增加大鼠在目标象限的时间及总路程(P< 0.05，P< 0.01)。还可显著降低模型大鼠血清中ACTH、CORT、CRH含量，升高海马组织5-HT，NE和DA的含量(P<0.05)。结论乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂具有一定的抗抑郁作用，其机制可能与增加海马组织中5-HT、DA、NE的含量，改善应激刺激导致的HPA轴功能紊乱状态有关。

乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂；慢性不可预知应激；抗抑郁；下丘脑-垂体-肾上腺轴；单胺类神经递质

抑郁症是一种情感性精神疾病，其发病机制与神经递质失调、内分泌功能紊乱以及大脑功能异常等有着密切的关系。临床上首选抗抑郁药物多以增加突触单胺类神经递质5-HT、NE、DA的含量为主，但是这些药物的起效时间缓慢，副作用多[1]。因此开发新型、高效、低毒副作用的抗抑郁中药制剂是近年来研究的热点。乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂是由乌灵菌粉和贯叶连翘提取物组成，乌灵参菌粉具有明显调节中枢神经系统功能的作用，临床常用于改善失眠、衰弱、焦虑、社交障碍等，其主要含有蛋白质、多糖、无机元素、维生素及腺苷类等化学成分；贯叶连翘又称之为圣约翰草，是英国皇家药典委员会郑重推荐治疗抑郁症的首选植物药，被世界卫生组织评定为“植物药之星”，主要含有：贯叶金丝桃素类化合物，黄酮类化合物及苯并二蒽酮类化合物等。本课题采用慢性不可预知应激与孤养相结合的方法建立抑郁模型，观察乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对该模型大鼠海马组织单胺类神经递质以及下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响，探讨其抗抑郁作用机制。

1　材料和方法

1.1实验动物

SPF级SD大鼠，72只，雄性，体重250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，实验室使用许可证号【SYXK(京)2011～0024】，室温为(23±2)℃，相对湿度为(65±5)%，实验前动物适应性饲养1周，自由摄取食水。

1.2药品与试剂

受试药物：乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂，褐色粉末，浙江佐力公司提供，临床人用量为2.1 g/60 kg，大鼠受试剂量根据临床人用量分别设为490 mg/kg，245 mg/kg，123 mg/kg，其中245 mg/kg为临床等效剂量；阳性对照药：盐酸氟西汀，PATHEONF RANCE有限公司，批号A078877，大鼠给药剂量为2.4 mg/kg。上述药物临用时以去离子水配成所需浓度的溶液，均灌胃(i.g.)给药。

血清皮质酮(CORT)放免试剂盒，美国Los Angles CA试剂公司；促肾上腺皮质激素(ACTH)放免药盒，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)放免药盒，北京华英生物技术研究所产品。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)，多巴胺(dopamine，DA)，以上试剂为标品，仅供含量测定用；均购自SIGMA公司。甲醇为色谱纯(Thermo Fisher Scientific，USA)，其他试剂为分析纯。

1.3主要仪器

R-911全自动放射免疫计数器，中国科技大学实业总公司；ESA 高效液相色谱仪，Model coulochem Ⅲ电化学检测器，Model 582 Pump(solvent delivery system)，C18色谱柱(5 μm，3.2 mm×150 mm)。循环水式多用真空泵，Heraeus Fresco 21高速冷冻离心机，pHS-3B精密pH计，JA1103N分析天平，小动物行为分析系统(Ethovision XT 9)，Morris水迷宫(Morris water maze)。

1.4动物分组及给药

大鼠置于自然昼夜节律光照条件下，适应性饲养1周，6只/笼。1周后根据体重随机分为正常对照组、应激模型组，模型+盐酸氟西汀组(2.4 mg/kg)，模型+乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂高、中、低剂量组(490 mg/kg、245 mg/kg、123 mg/kg)，实验期间正常对照组大鼠6只/笼，模型组及各给药组大鼠均单笼饲养。造模同时给药，给药体积10 mL/kg，每日一次，连续给药28 d。

1.5动物模型的建立

根据Willner的应激方法稍作改动。应激方法如下：电击足底(36 V，频率0.1 Hz，每次持续10 s，共20次)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、噪音刺激(2 h)、夹尾(1 min)、热应激(45 ℃，5 min)、制动(8 h)、昼夜颠倒(24 h)、冰水游泳(4℃，5 min)。除对照组外，应激组大鼠每天被迫接受应激，每日1种应激，连续处理28 d。于实验前随机抽取每日刺激方式，避免同一种应激方式连续使用。

1.6行为学检测

1.6.1糖水消耗实验

开始造模前1周对大鼠进行1%糖水偏好训练。于造模开始前进行第1次糖水偏好度测试。糖水偏好训练和测试均于大鼠禁水22 h后，测定2 h内饮用量(中途1 h时交换瓶子位置)。计算糖水偏嗜度，计算公式如下：

糖水偏嗜度(%)=糖水消耗/总液体消耗×100%。

1.6.2水迷宫实验

各组动物模型及灌胃结束后，次日进行Morris水迷宫。(1)定位航行实验(place navigation test)将水迷宫分为均等的4个象限，逃逸平台置于象限Ⅳ的中央，水深 50 cm(平台没于水下2 cm)，以其他3个象限迷宫壁中点为大鼠落水点，实验期间迷宫周围环境始终不变。大鼠入水时面对迷宫壁，观察并记录90 s内大鼠找到平台(要求大鼠找到平台并在平台上停留5 s以上)的时间，即逃避潜伏期(escape latency)，若90 s内未找到平台，则以90 s计。每次实验结束后让大鼠在平台上停留15 s(若大鼠在90 s内未能找到平台，则引导其爬上平台)以产生并加强记忆。依次从不同象限的入水点入水，每天训练1次，连续训练7 d。(2)空间探索实验(spatial probe test)第8天撤除水中平台，将大鼠自距原平台最远的象限(象限Ⅱ)放入水中，观察并记录在第Ⅳ象限(目标象限)运动的总路程和时间(时限90 s)。

1.7下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的检测

行为学结束后，断头的同时收集血样，室温下凝固，3000 r/min离心15 min，取上清，采用放免法，按照试剂盒说明进行血清CRH、ACTH、CORT浓度的检测。样本存放于-20℃冰箱中待测。

1.8单胺类神经递质的检测

大鼠断头后，于冰上分离大鼠脑组织，取出海马，按100 mg组织加入500 μL裂解液，匀浆，14000 r/min离心15 min，取上清，过膜(0.45 μm)，取20 μL进样，采用高效液相-电化学方法检测单胺类神经递质的含量。流动相：500 mL中含醋酸钠3.402 g，柠檬酸5.25 g，正辛基黄酸钠0.05 g，三乙胺660 μL，Na2EDTA 0.1 g，色谱甲醇25 mL。流速：0.4 mL/min，电压：0.3 v。主要检测海马去甲肾上腺素(NE)，多巴胺(DA)，5-羟色胺(5-HT)的浓度。样本保存于-70 ℃待测。

1.9统计学处理

2　结果

2.1乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性不可预知温和应激大鼠行为学的影响

2.1.1乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性不可预知温和应激大鼠糖水偏嗜度的影响

实验结果显示：与正常对照组相比，模型组大鼠糖水的偏嗜度明显降低(P<0.01)，而乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂各剂量组均能显著增加模型大鼠糖水偏嗜度(P<0.01)(表1)。

2.1.2乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性不可预知温和应激大鼠Morris水迷宫试验的影响

2.1.2.1各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较

实验结果显示：与正常对照组相比，从定位导航的第5次开始，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，与模型组相比，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂 490 mg/kg、245 mg/kg剂量组可明显缩短模型大鼠逃避潜伏期(P<0.05)(图1)。定位航行实验结果表明慢性应激可引起大鼠空间学习能力下降，导致空间学习障碍；乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂高、中剂量组可提高慢性应激大鼠的空间学习能力。

2.1.2.2各组大鼠空间搜索实验结果比较

实验结果显示：与正常对照组相比，模型组大鼠在目标象限的时间及总路程明显减少(P<0.05)，与模型组相比，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂490 mg/kg剂量组可增加模型大鼠在目标象限的时间及总路程(P<0.05)(表2)。空间探索实验结果表明，慢性应激可导致大鼠的空间记忆力减退，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂高剂量可改善应激大鼠空间记忆能力。

2.2乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性不可预知温和应激大鼠HPA轴的作用

实验结果表明：与正常对照组相比，模型组大鼠血清中的ACTH、CORT、CRH含量明显升高，而乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂490 mg/kg剂量组可显著降低ACTH、CORT、CRH含量(P<0.05)(表3)。

组别Group剂量Dose(mg/kg)例数n糖水偏嗜度(%)Sucrosepercentage(%)对照组Control-1182.92±3.11**模型组Model-1265.60±8.56氟西汀Fluoxetine2.41280.75±5.81**乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂WulingpowderandHypericumperforatumL.4901175.92±4.97**2451172.97±4.13**1231272.89±3.12**

注：与模型组比较，**P<0.01。

Note: Compared with the model group,**P<0.01.

图1　乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性应激模型大鼠定位导航持续时间的影响Fig.1　The effect of Wuling powder and Hypericum perforatum L. on place navigation test in CUS rats

组别Group剂量Dose(mg/kg)例数n目标象限总路程Routeoftargetquadrant(cm)目标象限总时间Timeoftargetquadrant(s)对照Control-111274.95±395.07*22.34±3.88*模型Model-121010.77±379.2018.21±5.31氟西汀Fluoxetine2.4121279.21±189.61*23.05±3.20*乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂WulingpowderandHypericumperforatumL.490111335.71±331.39*24.49±7.96*24591029.69±207.7019.18±2.38123111101.11±306.4421.69±4.59

注：与模型组比较，*P<0.05。

Note: Compared with the model group,*P<0.05.

组别Group剂量Dose(mg/kg)例数n促肾上腺皮质激素ACTH(pg/mL)皮质酮CORT(ng/mL)促肾上腺皮质激素释放激素CRH(pg/mL)对照组Contol-1028.58±7.39*340.94±39.00*5.35±1.26*模型组Model-1033.97±6.65393.38±59.467.13±1.96氟西汀Fluoxetine2.41028.76±5.74*344.36±48.36*5.87±0.99乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂WulingpowderandHypericumperforatumL.4901026.83±4.86*299.77±44.33*5.51±1.62*2451027.19±3.96*382.25±55.516.32±2.241231028.83±5.40365.15±55.886.69±1.17

注：与模型组比较，*P<0.05。

Note: Compared with the model group,*P<0.05.

2.3乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性不可预知温和应激大鼠海马单胺类神经递质的作用

实验结果表明：与正常对照组相比，模型组大鼠海马组织单胺神经递质5-HT，NE和DA明显降低(P<0.05)；与模型组相比，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂490 mg/kg剂量组可明显升高海马组织5-HT，NE和DA的含量(P<0.05)(表4)。

Tab.4Effects of Wuling powder andHypericumperforatum

组别Group剂量Dose(mg/kg)例数n5-羟色胺5-HT(ng/mL)去甲肾上腺素NE(ng/mL)多巴胺DA(ng/mL)对照组Control-10585.05±227.59*150.08±28.40*89.42±22.44*模型组Model-10418.22±101.05129.60±29.3175.91±13.05氟西汀Fluoxetine2.410624.24±109.05*175.50±36.06*101.77±28.37*乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂WulingpowderandHypericumperforatumL.49010639.78±147.43*173.65±32.04*84.37±17.69*24510378.73±100.03140.43±38.7865.48±15.3612310354.57±62.15119.61±41.4375.97±29.27

注：与模型组比较，*P<0.05。

Note: Compared with the model group,*P<0.05.

3　讨论

目前抑郁症的发病率呈逐年上升的趋势，成为研究热点。研究过程中，合理的抑郁动物模型是关键，主要包括环境应激模型、社会刺激模型、手术制备模型、转基因动物模型以及产后抑郁模型。其中，慢性不可预知应激致抑郁模型，因与实际生活中长期遭受低水平应激导致的抑郁症行为特征相似，如自主活动减少、兴趣缺失、探索能力以及学习能力低下等[2]，并且可伴与临床抑郁症患者相似的生理生化和激素水平等的改变，是公认的抑郁症模型。此外，该模型还具有成模率高、可持续性长等特点，广泛应用于药物筛选、机制的探究、心理行为变化等[3-5]方面研究。

本实验选用慢性不可预知应激加孤养模型，连续给药28 d，行为学结果显示，模型组大鼠糖水偏嗜度明显降低，与抑郁患者兴趣缺失的症状相似，给予乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂治疗后可显著增加慢性应激大鼠糖水偏嗜度。Morris水迷宫是常用于评价学习记忆能力的方法，用于检测空间学习能力和空间记忆能力，动物成功找到逃避潜伏期时间越长，空间学习能力越差，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂可缩短模型动物逃避潜伏期，改善模型动物学习记忆能力。上述行为学研究结果显示，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂对慢性应激抑郁模型大鼠具有一定的治疗作用。

应激反应会引起单胺递质含量不足、脑源性神经营养因子减少以及HPA轴功能失调[6-8]，其中最主要的特征是HPA轴活化，有研究表明抑郁症患者血清COR、ACTH的含量显著升高，且出现COR、ACTH分泌昼夜节律紊乱[9]。国外研究显示，海马是HPA轴负反馈的高级中枢，也是应激损伤的敏感部位，持续的应激刺激使会导致抑郁患者或动物脑内奖赏环路如前额皮层、杏仁核以及海马等脑区神经元萎缩，海马作为调控学习记忆功能的重要脑区，对于获取信息、巩固、储存记忆起着关键作用，慢性应激可降低模型大鼠海马组织中5-HT、NE、DA蛋白含量[10-13]。而中枢神经系统5-HT、NE等含量降低，则发生抑郁，本实验结果显示，模型组大鼠海马组织中5-HT、DA、NE的含量明显降低，血浆CORT、ACTH、CRH含量升高，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂可显著降低血浆CORT、ACTH、CRH的含量，升高海马组织单胺类神经递质。综上所述，乌灵菌粉贯叶连翘复方制剂具有抗抑郁作用，其机制与提高海马单胺类神经递质含量，调节HPA轴功能有关。

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Effects of mixture of Wuling powder andHypericumperforatumL. on depressed model rats induced by chronic unpredictable stress

LIU Xiao-meng1,2, ZHANG Rong1, DONG Shi-fen1, CHENG Gong-ni, CHANG Hong-sheng1, SUN Jian-ning1

(1. School of Chinese Material Medical, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China;2. National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100176, China)

ObjectiveTo observe the effects of Wuling powder andHypericumperforatumL. on changes of behavior, the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis function, and monoamine neurotransmitters concentration of hippocampus on chronic unpredictable stress model in rats. MethodsDepression model was induced by chronic unpredictable stress combining with solitary method. The stimulus lasted for 4 weeks. During the stress, the rats were intragastric given with the decoction of Wuling powder andHypericumperforatumL. (490 mg/kg, 245 mg/kg, 123 mg/kg) and Fluoxetine hydrochloride (2.4 mg/kg) for 4 weeks. At the end of the experiment, sucrose consumption and Morris Water Maze experiment monitor the behavior of rats, such as sucrose consumption, escape latency. Moreover, the levels of the monoamine neurotransmitters in the hippocampus were analyzed by high performance liquid chromatography-electrochemistry and the content of CORT, ACTH, CRH in plasma were detected by Radioimmunoassay. ResultsIn Morris Water Maze test, the escape latency of rats which were consecutively administrated with Wuling powder andHypericumperforatumL. for 4 weeks decreased obviously; the total time and distance in target quadrant remarkably increased (P< 0.05). In sucrose consumption experiment, the percentage in sugar water consumption with treatment of Wuling powder andHypericumperforatumL. increased significantly (P< 0.01). Meanwhile, the content of norepinephrine (NE), dopamine (DA) , and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in the hippocampus were significantly increased in rats of Wuling powder andHypericumperforatumL. and the concentrations of CORT, ACTH, CRH in plasma of Wuling powder andHypericumperforatumL. group rats were decreased obviously (P<0.05). ConclusionsThe disturbances of cognition, learning and memory function of rats induced by chronic unpredictable stress combining with solitary could alleviated by Wuling powder andHypericumperforatumL., and the pharmacological effects may related to modulation of monoaminergic neurotransmitters in the hippocampus and the content of CORT, ACTH, CRH in plasma.

Wuling powder andHypericumperforatumL.; Chronic unpredictable stress; Antidepressant; Hypothalamus-pituitary-adrenal axis; Neurotransmitter

刘晓萌(1981-)，女，助理研究员，学士，主要从事药物安全性评价工作，研究方向：中药药理。E-mail：liuxm@nifdc.org.cn；张荣(1990-)，女，硕士生，研究方向：中药神经精神药理研究。

孙建宁(1954-)，女，教授，博士生导师，研究方向：中药防治重大疾病创新药物研究，E-mail：jn_sun@sina.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0081-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.013

2016-02-01