糖尿病ZDF大鼠早期微血管并发症的生化指标及病理组织学变化

陈小真，戎亦骊，马全鑫，黄俊杰，朱科燕，陈　诚，施佳君，李园园，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州310053)



糖尿病ZDF大鼠早期微血管并发症的生化指标及病理组织学变化

陈小真，戎亦骊，马全鑫，黄俊杰，朱科燕，陈诚，施佳君，李园园，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州310053)

目的观察自发性2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)ZDF大鼠早期微血管并发症的生化指标及病理变化。 方法取6只7～8周龄的雄性ZDF大鼠适应性饲养3 d后，开始饲喂Purina#5008饲料，另取8只同周龄的雄性ZL大鼠为正常对照组，饲喂普通饲料。在12、14、16周龄时检测血糖(GLU)、血清胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、糖化血红蛋白(HbA1c)，16周龄时处死，并对眼球、肾、心、脑组织进行病理学检查。 结果ZDF大鼠GLU、CHOL、TG、HDL-C、LDL-C、hsCRP水平逐渐升高。16周龄时，ZDF大鼠RBP、mALB、TRF含量显著高于ZL大鼠(P<0.01)。肾小球、视网膜、心肌、脑部出现不同程度的微血管病变，肾小球部分血管基膜增厚，视网膜内皮细胞增多，血管壁增厚，心脏出现少量心肌纤维化，海马区神经元异常。 结论ZDF大鼠在16周龄时出现T2DM早期微血管并发症，其中T2DM早期肾病、视网膜病变、心肌病变较为突出，脑神经元轻微病变。

微血管；2型糖尿病；病理；ZDF大鼠

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一种代谢紊乱性疾病，可引发多种微血管和大血管并发症，并伴有冠心病、高血压、脑血管病、肾病、眼部并发症、神经病变、脂血症、脂肪肝等并发症，其中微血管并发症包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)、糖尿病神经病变及糖尿病心肌病等[1]。目前关于1型糖尿病微血管病变的研究较多，对T2DM微血管病变的研究较少。Zucker糖尿病肥胖大鼠(zucker diabetes fatty，ZDF)是从出现糖尿病表型的Zucker大鼠中筛选出来的，是一种新型的自发性T2DM模型[2]。在高脂饲喂后出现高血糖与高胰岛素血症，并伴有肥胖、脂质紊乱及糖耐量异常等代谢综合征[3]，与人类T2DM发病进程相似，因此本文选取ZDF大鼠为研究对象，以Zucker瘦型大鼠(zucker lean，ZL)作为对照，观察ZDF大鼠糖尿病早期微血管并发症的生化指标及相关组织的病理改变，并探讨其发病特点。

1　材料和方法

1.1实验动物及实验环境

SPF级7～8周龄雄性ZDF大鼠6只及同周龄的雄性ZL大鼠8只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2012-X001】；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障实验室【SYXK(浙)2013-184】，环境温度：(22±2)℃，相对湿度：50%～60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪声<50 dB；在IVC笼内饲养，自由饮食，并在实验过程中按实验动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。

Purina#5008营养组分：蛋白质23.75%、总脂肪7.55%、粗纤维4.00%、消化能14.6 KJ/kg。

1.2试剂与仪器

Advantage血糖仪(德国罗氏公司)，Bouin氏固定液(苦味酸饱和溶液，冰醋酸，甲醛)，Premier Hb9210型糖化血红蛋白分析仪(爱尔兰Trinity Biotech公司)，7020 型全自动生化分析仪(日本日立公司)，大鼠转铁蛋白(TRF)ELISA试剂盒，大鼠视黄醇结合蛋白(RBP)ELISA试剂盒，大鼠尿微量白蛋白(mALB)试剂盒，超敏C反应蛋白(hsCRP)ELISA试剂盒，购自杭州诚维生物科技有限公司，Thermo光谱扫描多功能酶标仪(美国Thermo公司)，ST5010染色机 (德国Leica公司)，80I相差显微镜(日本Nikon公司)。Masson试剂盒，PAS试剂盒，购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1动物分组：

ZDF大鼠适应性饲养观察3 d后开始饲喂Purina#5008饲料，作为模型组(Model group)。ZL大鼠饲喂普通饲料，作为正常对照组(Control group)，并在8周时处死动物。

1.3.2血液生化指标测定

动物在禁食12 h后，分别在8、10周龄时，尾尖取血，血糖仪测定GLU；在12、14、16周龄时，尾静脉取血0.5 mL，3000 r/min离心10 min，分离血清，用全自动生化分析仪检测GLU、CHOL、TG、HDL-C、LDL-C。取全血200 μL，用糖化血红蛋白分析仪测定HbA1c。

16周龄时，收集大鼠24 h尿液，利用ELISA试剂盒检测尿液中TRF、mALB的含量；同时用ELISA试剂盒检测大鼠血清中hsCRP、RBP的含量。

1.3.3病理组织学观察

大鼠16周龄时，解剖取心、肾、脑、眼球，分别进行组织固定及染色。取心脏组织进行马松(Masson)染色，脑组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色，肾脏组织切片进行糖原(PAS)染色，光学显微镜下观察病理变化。

取各组实验动物的左眼球，在Bouin氏固定液固定24 h后，以视乳头为中心，垂直于虹膜切开，固定、脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色，观察视网膜厚度。参照潘琳[4]的方法，取各组实验动物的右眼球，通过视网膜毛细血管消化铺片，进行PAS染色。

1.4统计学方法

2　结果

2.1一般情况与体重变化

正常对照组ZL大鼠生长良好，活动灵活，毛色健康，无其他症状；ZDF大鼠采食量、饮水量增加，毛色无光泽、枯黄，尿量及排泄物增多。ZDF大鼠体重显著高于ZL大鼠(P<0.01)，实验期间，ZL大鼠体重持续增加，ZDF大鼠在8～10周龄快速增长，而从12周龄起开始缓慢增长。

2.2空腹血糖的变化及HbA1c水平

ZDF大鼠在12周龄时空腹血糖显著上升，显著高于ZL大鼠(P<0.05，P<0.01)，14周龄起血糖增长缓慢(图1)。

在16周龄时，ZDF大鼠HbA1c水平显著高于ZL大鼠(P<0.01)(图2)。

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图1　ZDF大鼠体重和空腹血糖的变化Note： Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Fig.1　Changes of weight and GLU in ZDF rats

注：与正常对照组相比，**P<0.01。图2　ZDF大鼠HbA1c水平Note： Compared with the control group, **P<0.01.Fig.2　Level of HbA1c in ZDF rats

2.3血脂和血清hsCRP变化

12、14、16周龄时，ZDF大鼠血清CHOL、TG、HDL-C均显著高于ZL大鼠(P<0.01)，LDL-C在14、16周龄时显著高于ZL大鼠(P<0.01)(图3)。

16周龄时，ZDF大鼠血清hsCRP显著高于ZL大鼠(P<0.01)(图4)。

2.4血清RBP和尿液mALB、TRF的含量变化

16周龄时，ZDF大鼠血清RBP和尿液中mALB、TRF含量显著高于ZL大鼠(P<0.01)(图5)。

2.5病理组织学变化

2.5.1视网膜病变

眼球石蜡切片HE染色显示ZL大鼠视网膜内、外界膜排列整齐，神经纤维层排列紧密，血管壁未见增厚；ZDF大鼠视网膜神经纤维层局部疏松，血管壁增厚，各层细胞排列紊乱，同时，可见部分脉络膜层血管壁轻度增厚(图6)。在NDP.view2软件中，每只大鼠各选取5个点，测量从内界膜到视网膜色素上皮细胞层的厚度，计算各组视网膜平均厚度，发现ZDF大鼠视网膜厚度较ZL大鼠增厚，存在显著性差异(P<0.01)(图7)。

视网膜毛细血管消化铺片后，进行PAS染色，结果显示ZL大鼠视网膜血管内皮细胞和周细胞分布规则，未发现增生或凋亡；ZDF大鼠视网膜内皮细胞增多且部分增生，细胞核大小不一，周细胞减少(图6)。

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图3　ZDF大鼠血脂变化Note： Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Fig.3　Changes of lipid in ZDF rats

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图4　ZDF大鼠血清hsCRP变化Note： Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Fig.4　Changes of serum hsCRP in ZDF rats

2.5.2肾脏病变

肾脏石蜡切片经HE染色显示，ZL大鼠肾小球、肾小管结构完整，无炎性细胞浸润和纤维变化；ZDF大鼠肾小球肥大，肾小球基膜增厚，系膜细胞增生，分布弥散，挤压毛细血管。

PAS染色显示ZL大鼠肾小球无明显病理改变，结构完整，系膜区未见异常；ZDF大鼠肾小球体积略有增大，系膜轻度增生，系膜区增宽，部分毛细血管基膜增厚，肾小球血浆蛋白出现部分玻璃样变性(图8)。

2.5.3心肌病变

由HE染色可见ZL大鼠心肌细胞排列整齐，结构清晰，心肌纤维形态结构无明显异常；ZDF大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，细胞核大小不规则，成纤维细胞增多，可见少量炎性细胞浸润。

Masson染色显示ZL大鼠心肌间质和血管周围存在少量胶原纤维，排列整齐，细胞间隙均匀；ZDF大鼠心肌间质出现少量心肌纤维化，胶原纤维沉积，排列紊乱，细胞间隙扩大(图9)。

2.5.4脑部病变

脑组织切片，HE染色显示ZL大鼠海马CA3区神经元分布整齐，排列规则，海马齿状回颗粒层细胞排列整齐，未见核固缩等明显变化；ZDF大鼠海马CA3区神经元排列出现紊乱，海马齿状回颗粒层部分神经元异常，排列紊乱，细胞核变小(图10)。

3　讨论

DM发病率逐年上升，DM并发症的不断恶化是其致残和致死的主要原因，已成为人类健康的重大威胁，预计到2030年，糖尿病患者将增至3.8亿，其中T2DM占总数的90%以上[5]。近来Gupta[6]等研究发现在无症状的T2DM患者中，微血管病变的发生率亦高达为32.55%。微血管并发症主要表现在视网膜、肾、心肌、神经组织及足趾等部位，使患者深受病痛折磨。

注：与正常对照组相比，**P<0.01。图5　ZDF大鼠血清RBP和尿液mALB、TRF的变化Note： Compared with the control group, **P<0.01.Fig.5　Changes of serum RBP, urine mALB and TRF in ZDF rats

注：A：正常对照组，HE染色；B：模型组，HE染色；标尺=100 μm；C：正常对照组，消化铺片PAS染色；D：模型组，消化铺片PAS染色；标尺=50 μm。图6　ZDF大鼠视网膜病理组织学变化Note： A: Control group, HE staining; B: Model group, HE staining; Bar=100 μm; C: Control group, PAS staining; D: Model group, PAS staining. Bar=50 μm.Fig.6　Histopathological of retinal staining in ZDF rats

目前，ZDF大鼠多用于T2DM及其并发症的研究[7-8]。本实验结果显示：ZDF大鼠在16周龄时，体重、采食量、饮水量、尿量、血脂血糖、视黄醇结合蛋白(RBP)、微量白蛋白(mALB)、转铁蛋白(TRF)均显著上升，且出现肾、视网膜、心脏、脑的病理组织学异常，具体表现为肾小球部分血管基膜增厚，系膜增生；视网膜内皮细胞有所增多，血管壁增厚；心脏出现少量心肌纤维化，海马区神经元异常，说明此时已出现T2DM早期微血管并发症。

注：与正常对照组相比，**P<0.01。图7　ZDF大鼠视网膜厚度变化Note： Compared with the control group, **P<0.01.Fig.7　Measurement of Retinal thickness in ZDF rats

注：A：正常对照组，HE染色；B：模型组，HE染色；标尺=50 μm；C：正常对照组，PAS染色；D：模型组，PAS染色；标尺=50 μm。图8　ZDF大鼠肾脏PAS和HE染色Note： A: Control group, HE staining; B: Model group, HE staining; Bar=50 μm;C: Control group, PAS staining; D: Model group, PAS staining; Bar=50 μm.Fig.8　Histopathological of kidneyin ZDF rats by PAS staining and HE staining

注：A：正常对照组，HE染色；B：模型组，HE染色；标尺=100 μm；C：正常对照组，Masson染色；D：模型组，Masson染色；标尺=100 μm。图9　ZDF大鼠心脏HE和Masson染色Note： A: Control group, HE staining; B: Model group, Masson staining; Bar=100 μm;C: Control group, HE staining; D: Model group, Masson staining; Bar=100 μm.Fig.9　Histopathological of myocardium in ZDF rats by HE staining and Masson staining

注：A：正常对照组，CA3区；B：模型组，CA3区；标尺=100 μm；C：正常对照组，齿状回；D：模型组，齿状回；标尺=100 μm。图10　ZDF大鼠脑部切片HE染色Note： A: Control group,CA3; B: Model group,CA3;Bar=100 μm;C: Control group, dentate gyrus; D: Model group, dentate gyrus; Bar=100 μm.Fig.10　Histopathological of brain in ZDF rats by HE staining

微血管并发症形成的过程大致为：微循环功能性改变，内皮损伤，基膜增厚，红细胞聚集，血小板粘附和聚集，最后是微血栓形成和微血管闭塞。微血管基底膜增厚是T2DM微血管病变的一种较早表现。实验表明，ZDF大鼠在饲喂4周后，空腹血糖显著上升，HbA1c高于ZL大鼠。hsCRP是肝脏分泌的炎症反应蛋白，在T2DM发生、发展中起着非常重要的作用，在16周龄时，ZDF大鼠血清hsCRP含量显著高于ZL大鼠，出现倍数增长，说明炎症反应加剧，提示hsCRP水平可以作为T2DM早期微血管并发症的评估指标，同时，ZDF大鼠血清CHOL、TG、HDL-C含量均显著高于ZL大鼠，LDL-C含量较ZL大鼠有所升高，有可能是肝、肾功能异常所致，其结果有待进一步研究。RBP、mALB、TRF是糖尿病早期肾损伤的敏感指标，可灵敏地反映肾脏损害的程度，被认为是T2DM早期微血管并发症的重要指标。RBP主要从肾脏排泄，当肾小球滤过率降低，血中的RBP贮存，说明肾功能受损；mALB是DN最早出现变化的生化指标之一，是肾脏和心血管系统改变的早期标志；TRF则是作为早期肾小管受损的标志性微量蛋白。实验显示ZDF大鼠在16周龄时RBP、mALB、TRF含量升高，推测肾脏细胞已处于增殖和肥大状态、肾小球滤过障碍，肾功能已减退。

糖尿病视网膜病变(DR)是T2DM常见微血管并发症，已经成为全球致盲的重要原因，研究表明，DR也是其他血管并发症的早期常见表现[9]。早期病变首先引起微血管功能改变，使视网膜血管扩张，引起周细胞变性、基底膜增厚和内皮细胞增生[10]。本实验研究发现，ZDF大鼠视网膜神经纤维层局部出现疏松，血管壁增厚，各层细胞排列紊乱，部分脉络膜层血管壁轻度增厚；视网膜PAS染色显示，内皮细胞增多，部分增生，细胞核大小不一，周细胞减少，提示在机体炎症反应的促进下，ZDF大鼠16周龄时已出现T2DM早期视网膜病变。

糖尿病肾病(DN)是由肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常，已经严重影响患者的生活质量，发病率已上升至56%[11]，其主要病理变化为肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、肾小管间质纤维化，研究发现，SD大鼠DM造模4周后，动物出现早期DN症状[12]。ZDF大鼠肾脏HE和PAS染色，发现部分肾小球部分血管基膜增厚，系膜增生，提示已经有一定程度的肾功能障碍，出现T2DM早期DN微血管病变。

目前认为T2DM大血管并发症是导致DM心肌病的主要原因，但越来越多的研究表明T2DM微血管并发症也能够影响心脏的结构与功能[13-14]。心肌病变与T2DM微血管病变密切相关，微循环功能障碍会引起心肌纤维化及心肌缺血[15]。心脏切片Masson染色显示，ZDF大鼠出现少量心肌纤维化以及胶原沉积，提示可能在高糖刺激下，内皮细胞紊乱，血管通透性增强，毛细血管增生、变厚，导致T2DM早期微血管并发症出现心肌病变。

T2DM出现的认知功能障碍是由多种因素参与的复杂病理过程，其中糖代谢紊乱会使氧化应激增强，导致神经退行性病变[16]，慢性持续的高血糖引起大脑神经元损伤及凋亡，损伤微血管，进一步诱发T2DM神经病变。ZDF大鼠脑部HE染色显示海马区部分神经元异常，推测大鼠的学习与记忆能力可能已经降低，出现早期的认知功能障碍。

综上所述，ZDF大鼠饲喂Purina#5008饲料后，在16周龄时出现T2DM微血管并发症早期病变；在T2DM早期，肾脏、视网膜、心肌、大脑已经出现不同程度的微血管损伤，与高糖以及高糖引起的炎症反应密切相关。对ZDF大鼠T2DM早期微血管并发症的生化与病理组织学变化的研究有助于T2DM微血管并发症的防治，对T2DM微血管并发症的早期诊断具有重要意义。

[1]Chen L，Magliano DJ，Zimmet PZ. The worldwide epidemiology of type 2 diabetes mellitus-present and future perspectives[J].NatRevEndocrinol，2012，8(4):228-236.

[2]Davidson EP，Coppey LJ，Holmes A，etal. Characterization of Diabetic Neuropathy in the Zucker Diabetic Sprague-Dawley Rat: A New Animal Model for Type 2 Diabetes[J]. Journal of diabetes research，2014，DOI: 10.1155/2014/714273.

[3]奚赛飞，斯徐伟，朱科燕，等. ZDF(fa/fa) 大鼠的糖脂代谢特点与胰岛素抵抗特性[J]. 实验动物与比较医学，2014，34(2):102-106.

[4]潘林. 实验病理学技术图鉴 [M]. 王太龄. 北京: 科学出版社，2012: 506-510

[5]Forouhi NG，Wareham NJ: Epidemiology of diabetes[J]. Medicine (Abingdon) 2014，42(12):698-702.

[6]Gupta A，Gupta A，Singh T. Occurrence of complications in newly diagnosed type 2 diabetes patients: a hospital based study[J].Journal of the Indian Medical Association，2013，111(4):245-247.

[7]Topp BG，Atkinson LL，Finegood DT. Dynamics of insulin sensitivity，β-cell function，and β-cell mass during the development of diabetes in fa/fa rats[J]. Am JEndocrinolMetab，2007，293(6): E1730-E1735.

[8]Futamura M，Yao J，Li X，etal. Chronic treatment with a glucokinase activator delays the onset of hyperglycaemia and preserves beta cell mass in the Zucker diabetic fatty rat[J]. Diabetologia，2012，55(4): 1071-1080.

[9]Cheung N，Wong TY. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications[J]. Prog Retin Eye Res，2008，27(2): 161-176.

[10]陈雨，朱晓华. 糖尿病视网膜病变发病机制的研究进展[J]. 国际眼科杂志， 2006，6(2): 433-435.

[11]Naqshbandi M，Harris SB，Esler JG，etal. Global complication rates of type 2 diabetes in Indigenous peoples: A comprehensive review[J]. Diabetes research and clinical practice，2008，82(1): 1-17.

[12]唐丽琴，刘圣，陈礼明，等. 复方黄连胶囊对糖尿病大鼠血脂及血液流变学的影[J]. 中国药房，2007，18(15): 1129-1131.

[13]符丽娟，庞东渤. 糖基化终产物在糖尿病大鼠心肌病变中的作用[J]. 中国微循环，2009，13(4): 277-279.

[14]简春燕，吴铿. 糖尿病性心肌病发病机制和治疗的研究现状[J]. 中华临床医师杂志，2012，6(1): 164-167

[15]Boussageon R，Bejan-Angoulvant T，Saadatian-Elahi M，etal. Effect of intensive glucose lowering treatment on all-cause mortality，cardiovascular death，and microvascular events in type 2 diabetes: Meta-analysis of randomized controlled trials[J]. BMJ，2011，343.

[16]McCrimmon RJ，Ryan CM，Frier BM. Diabetes and cognitive dysfunction[J]. Lancet，2012，379(9833): 2291-2299.

Biochemical indicators and pathological changes of early microvascular complications in spontaneous type 2 diabetesmellitus (T2DM) ZDF rats

CHEN Xiao-zhen, RONG Yi-li, MA Quan-xin, HUANG Jun-jie,ZHU Ke-yan, CHEN cheng, SHI Jia-jun, LI Yuan-yuan, CHEN Min-li

(Laboratory Animal Research Center Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

ObjectiveTo investigate the biochemical indicators and pathological changes of early microvascular complications in spontaneous type 2 diabetes (T2DM) ZDF rats. Methods Six male ZDF rats aged around 7-8weeks were allowed to acclimate for 3days after feeding Purina#5008, eight male ZL rats at the same age were assigned to control group, fed with regular diets. At 12,14,16week, blood glucose (GLU), serum cholesterol (CHOL), triglyceride (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP), glycated hemoglobin (HbA1c) were detected. All rats were sacrificed at 16 week and pathological examinations were applied to eye, kidney, heart, brain tissues. Results GLU, CHOL, TG, HDL-C, LDL-C, hsCRP levels in ZDF rats were increased gradually (P<0.01). At 16 week, RBP, mALB, TRF contents in ZDF rats were significantly higher than ZL rats (P<0.01). Glomeruli, retina, myocardium, brain tissue showed varying degrees of microvascular disease, vascular basement membrane of the glomerular part appeared thicken, retinal endothelial cells were increased, vascular wall was thicken, and the heart showed a small amount of myocardial fibrosis, hippocampal neurons appeared abnormal. ConclusionsZDF rats showed early microvascular complications of T2DM at16 week, among which T2DM early nephropathy, retinopathy, cardiomyopathy become more prominent, cerebral neuron appeared slight lesion.

Microvessel; Type 2 diabetes mellitus; Pathology; ZDF rats

浙江省中医药管理局重点项目(2015ZZ009)；比较医学创新团队(XTD201301)。

陈小真(1991-)，女，硕士生，研究方向：中药药理与比较医学，E-mail：sochenxiaozhen@126.com。

陈民利(1963-)，女，教授、硕士，研究方向：实验动物与比较医学，E-mail：cmli991@aliyun.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0063-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.010

2016-02-01