东方次睾吸虫PCR检测方法的建立及初步应用

那璐，高俊峰，2，仇建华，李荣，邵志辉，张艳，王春仁

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.黑龙江省兽医科学研究所）

东方次睾吸虫PCR检测方法的建立及初步应用

那璐1，高俊峰1，2，仇建华1，李荣1，邵志辉1，张艳1，王春仁1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.黑龙江省兽医科学研究所）

为了快速准确地检测鸭、犬等动物东方次睾吸虫的感染情况，根据GenBank中发表的东方次睾吸虫ITS序列设计一对特异性引物，以粪便样品中虫卵DNA为模板，优化PCR反应条件，经过敏感性、特异性和重复性实验，建立检测动物粪便中东方次睾吸虫虫卵的方法。结果，阳性样品可扩增得到260 bp的特异性条带，华支睾吸虫、卷棘口吸虫、纤细背孔吸虫DNA样品检测均为阴性，检测到的最低虫卵数为0.031 25个/克粪便，表明研究建立的PCR检测方法具有较高的特异性和灵敏性。临床检测87份鸭粪样本，其中6份为阳性，阳性率为6.9%，结果显示大庆地区鸭子存在东方次睾吸虫感染，所建立的方法适合于鸭子及其他家禽东方次睾吸虫的检测。

东方次睾吸虫；PCR检测方法；建立；应用

东方次睾吸虫（Metorchis orientalis）隶属于后睾科（Opisthorchiidae）、次睾属（Metorchis），主要寄生于鸡鸭等禽类的胆管和胆囊内，也可寄生于犬、猫，人也有感染的报道［1-2］。该病主要流行于我国，福建、黑龙江、安徽等10多个省区有感染的报道［1-4］。动物感染后会出现胆囊高度肿大，肝胆区疼痛、腹痛、腹泻、体重减轻、消瘦、贫血等症状，严重时会导致死亡，给畜牧业造成很大经济损失。

目前对该病的诊断主要是传统的形态学观察，通过对虫体和虫卵进行形态鉴定来确诊。在实际生产中，当虫卵较少或混合感染时容易造成漏检或误诊；对解剖发现的成虫进行鉴定虽然准确，但需要剖杀动物，还需要制作装片才能确定。目前还未发现该病的免疫学诊断方法，因此我们迫切需要寻找一种快速、简便、特异、敏感的方法。随着科学技术的发展，越来越多的人意识到聚合酶链式反应（PCR）在临床诊断中的有效应用，从细菌到病毒再到寄生虫，PCR秉承着其快捷、准确、安全的优点不断进步，不断发展。因此，实验拟建立一种快速、简便、准确的检测东方次睾吸虫虫卵的PCR方法，并进行临床样品检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体

采自大庆市周边鸭场粪便样本若干份，-20℃保存；东方次睾吸虫DNA及对照虫体DNA：华支睾吸虫DNA、卷棘口吸虫DNA、纤细背孔吸虫DNA均由黑龙江八一农垦大学寄生虫实验室制备保存。

1.1.2 主要试剂

dNTP Mixture、Ex Taq酶和DNA Marker为大连宝生物（Takara）公司产品；溴化乙锭（EB）、琼脂糖、Tris碱、Tris Base、EDTA、裂解液、液氮、蛋白酶K、Tris饱和酚（4℃保存）、三氯甲烷、醋酸钠、无水乙醇、蒸馏水、酒精等为进口或国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

将GenBank上发表的东方次睾吸虫ITS基因序列［5］与华支睾吸虫等的ITS序列进行对比，寻找突变区设计一对引物GN1。应用Oligo 6.0软件设计引物，引物序列为GN1 F：5’-TGT ACC CAG TGT GTG TGC CT-3’和GN1 R：5’-GCA GTG AGA CAA GCT AGA CA-3’，预测扩增大小为260 bp。由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 粪便中虫卵DNA的提取

参照王珍丽等［6］血吸虫虫卵DNA的快速提取法，进行改良。

1.2.3 PCR进行扩增

以从鸭粪便中提取出的东方次睾吸虫虫卵（动物接种实验证实成虫为东方次睾吸虫）的DNA为模板，利用设计的特异性引物对东方次睾吸虫核糖体ITS部分序列进行扩增，反应体系25 μL，PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共30个循环；最后72℃延伸7 min，反应结束后，取反应产物5 μL，混入1 μL的6×Loading buffer，用移液枪混匀后加入配置好的1%琼脂糖凝胶中，进行电泳25 min，取出后，用凝胶成像仪观察结果并记录下来。

1.2.4 特异性实验

以东方次睾吸虫DNA、华支睾吸虫DNA、卷棘口吸虫DNA、纤细背孔吸虫DNA为模板，进行PCR扩增，同时设阴性对照。

1.2.5 敏感性实验

将感染寄生虫的鸭子的阳性粪样在显微镜下对虫卵进行计数，所检的虫卵依次为100个、10个和1个/克粪便，同时将每克粪便1个虫卵提取的DNA模板倍比稀释后进行PCR扩增，以确定最小虫卵检出量。

1.2.6 重复性实验

为保证实验的可靠和准确性，随机抽取6个阳性样品和6个阴性样品，用建立的PCR方法进行3次重复性实验，以验证实验的重复性。

1.2.7 临床样品检测

采集黑龙江省大庆周边个体养殖的鸭粪样87份，应用建立的PCR检测方法对粪样中东方次睾吸虫虫卵检测。选择检测出的阴阳鸭子各2只进行剖检，以确定建立方法的准确性。

2 结果

2.1 特异性实验

PCR产物经过凝胶电泳观察后，得出结果，从图1可看出，只有东方次睾吸虫在260 bp位置出现一条与预计片段大小相符的条带，而华支睾吸虫、卷棘口吸虫、纤细背孔吸虫和阴性对照组均未扩增出目的条带，表明该方法具有较好的特异性。

图1 PCR特异性检测扩增结果Fig.1 The results of PCR specific detection

2.2 敏感性实验

以100个、10个和1个虫卵DNA按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀释后DNA为模板进行PCR扩增，结果随着DNA浓度的降低，目的条带的亮度也越来越弱，在稀释到1∶32之后，特异性条带消失（图2）。即确定每克粪便中含有0.031 25个虫卵时为PCR检测的最小剂量，表明该方法具有良好的敏感性。

图2 PCR敏感性检测扩增结果Fig.2 The results of PCR sensitive detection

2.3 重复性试验

随机抽取的6份阳性和阴性样品，用建立的PCR方法进行扩增，再经琼脂糖凝胶电泳显示阳性样品在260 bp的位置处出现了目的条带，为确保实验的准确性，我们将实验重复几次，最终得到的结果一致，证明该方法具有良好的重复性。

2.4 临床样品的检测

用建立的PCR诊断方法对大庆市周边禽场的鸭子粪便进行检测，随机提取87份粪便DNA，进行检测。结果显示，6份经PCR扩增后出现阳性条带（图3），感染率为6.9%。剖杀的2只阳性鸭子均在肝脏中检出东方次睾吸虫，而2只阴性鸭子没有检出虫体。

图3 部分样品检测结果Fig.3 The results of sample detection

3 讨论

寄生虫的准确分类和鉴定是从事一切寄生虫学和寄生虫病学研究的基础。由于一些寄生虫有着十分相近的形态和发育史，给传统的形态学分类和鉴定带了一定的困难，阻碍了一些科研工作的顺利进行。近年来，随着分子生物学技术的蓬勃发展，PCR技术已经广泛地应用于病毒、真菌、细菌等各个领域［7-8］。寄生虫学的研究也不例外，目前应用也较多，特别是用于检验动物粪便中虫卵。如人蛔虫卵、熊猫蛔虫卵、犬细粒棘球绦虫卵和日本血吸虫虫卵的检测等［6，9-11］，然而对于东方次睾吸虫虫卵的检测还未见报道。

研究中，通过网上已有的东方次睾吸虫的基因序列，在其基因的变异区设计一对特异性引物，用来鉴别与东方次睾吸虫形态极为相近的一些吸虫。研究使用的样品为来自粪便中的虫卵，所以粪便中虫卵DNA的成功提取为实验成功的关键。提取粪便中虫卵的DNA方法有多种，其中一种方法是用商品试剂盒提取，虽效果很好，但成本较高。试验所用的方法为改良的有机溶剂提取法，不仅可以提取出较多量的DNA，同时可以浓缩出较为纯净的DNA。能够满足后续实验要求，同时具有简单、方便、价格便宜和可操作性强等优点。实验成功地建立了检测家禽粪便中东方次睾吸虫虫卵的PCR方法，该方法与已知的阴阳样品符合率为100%，具有快速、简便、特异、敏感等优点，临床样本检测显示大庆地区鸭子存在东方次睾吸虫感染。

［1］陈宝建，张智芳，李莉莎，等.东方次睾吸虫病的研究进展［J］.海峡预防医学杂志，2013，19（5）：18-20.

［2］林金祥，程由注，李友松，等.人体自然感染东方次睾吸虫的发现及其疫源地的调查研究［J］.中国人兽共患病学报，2001，17（4）：19-21.

［3］邹希明，王超，王春仁，等.珍珠鸡和白头鹤体内两种吸虫的形态鉴定［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2010，22（3）：53-57.

［4］朱玉霞，孙恩涛.淮南地区发现东方次睾吸虫［J］.皖南医学院学报，2012，31（2）：143-144.

［5］Ai L，Chen S H，Zhang Y N，et al.Sequences of internal transcribed spacers and two mitochondrial genes：effective genetic markers for Metorchis orientalis［J］.Journal of Animal&Veterinary Advances，2010（18）：2371-2376.

［6］王珍丽，汪天平，汪奇志，等.粪便中日本血吸虫虫卵DNA的提取及PCR检测方法的优化［J］.热带病与寄生虫学，2009（3）：125-128.

［7］李业鹏，钟凯，杨宝兰，等.食品中沙门菌PCR检测方法的建立［J］.中国食品卫生杂志，2006，18（1）：17-22.

［8］张立媛，高旭，陈海迪，等.犬系小病毒YBYJ株的分离鉴定及VP2基因的序列分析［J］.安徽农业科学，2014，42（27）：9370-9378.

［9］Leles D，Araújo A，Vicente A C P，et al.Molecular diagnosis of ascariasis from human feces and description of a new Ascaris sp.genotype in Brazil［J］.Veterinary Parasitology， 2009，163（1）：167-170.

［10］Wang N，Li D S，Zhou X，et al.A sensitive and specific PCR assay for the detection of Baylisascaris schroederi eggs in giant panda feces［J］.Parasitology International，2013，62（5）：435-436.

［11］张亚楼，温浩，马旭东，等.家犬粪便中的细粒棘球绦虫DNA PCR检测方法的建立［J］.中国病原生物学杂志，2006（5）：363-365.

Establishment and App lication of PCR M ethods of Meotrchis orientalis

Na Lu1，Gao Junfeng1，2，Qiu Jianhua1，Li Rong1，Shao Zhihui1，Zhang Yan1，W ang Chunren1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science）

To establish a method for detecting Meotrchis orientalis，two specific primers were synthesized according to the sequence of ITS rDNA of M.orientalis on the GenBank to amplify the DNA in the eggs by optimizing PCR conditions，then evaluating sensitivity，specificity and repeatability.Finally，a method of detect ing M.orientalis was set up.The results showed that the obtained specific band was 260 bp，and under the same constraint，PCR assay was negative to Clonorchis sinensis，Echinostoma revolutum，Notocotylus attenuatus，Echinostoma revolutum DNA.The method’s minimum detect limit was 0.031 25 eggs DNA per gram feces.Among 87 clinical samples there were six positive samples，so the positive rate was 6.9%.The results indicated that there was M.orientalis in the poultry farm in Daqing city.The PCR method had high sensitivity and specificity，which could be used to diagnose M.orientalis in ducks and other poultry.

Metorchis orientalis；PCR method；establishment；application

S856.5

A

1002-2090（2016）03-0043-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.009

2015-03-28

黑龙江省青年科学基金项目（QC2014C033）；家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金（SKLVEB2014KFKT006）；国家大学生创新创业训练计划项目（201410223001）。

那璐（1988-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2012级硕士研究生。

王春仁，男，教授，博士研究生导师，E-mail：chunrenwang@sohu.com。