健骨方治疗膝骨关节炎疗效机制的实验研究

何伟 李博宁 李同生 杨功旭 黎祥胜 彭静

1.湖北省中医院，武汉 430070 2.湖北中医药大学

膝关节退行性骨关节炎(KOA)多见于中老年人，是损害人类健康，影响人口劳动力和生活质量的一个严重疾病，造成巨大的社会和家庭负担[1]，其发病机制尚不清楚。最近研究表明p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路在OA的发病中也扮演着重要的作用[2]。

祖国医学认为膝关节骨性关节炎属于“痹证”、“痛痹”、“骨痹”、“鹤膝风”等范畴。本研究应用名老中医李同生祖传秘方健骨方治疗大鼠膝骨性关节炎。我们采用大鼠前交叉韧带切断(ACLT)方法建立OA模型[3],观察健骨方干预大鼠膝骨关节炎p38MAPK信号传导通路的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

SD清洁级大鼠40只，4个月龄，重达200±20 g，雌雄比例1∶1，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供(许可证号：SCXK(鄂)2010-0009)。将雌雄大鼠随机分成四组，随机分为正常组、模型组、健骨方组、阳性对照组。各组动物均在同一条件下雌雄分笼饲养，进食普通饲料，自然光照，温度20℃±2℃，湿度50%左右，与实验前适应喂养1周。

1.2 实验药物的配制

临床患者一日一剂的健骨方总重为146 g，患者体重70 kg，则患者日用量为2.086 g/kg。据体表面积等效剂量换算公式[4]：D1=D2×R1/R2×(W2/W1)1/3,计算出SD大鼠等效剂量为13.45 g健骨方/kg。阳性对照药等效剂量为18.43 mg/kg。

制法：为保证中药有效成分含量，与患者煎药一样。健骨方1付，加水没过药物2横指，先煎猴骨等药物30 min，在下其他中药煮沸后文火煎煮20 min，过滤。继续在中药中加水没过药物2横指，煮沸后20 min过滤。混合二次药液，此法共煎10剂，4℃冰箱保存备用。

阳性对照药配制：取塞来昔布胶囊内容物18.43 mg，5%CMC研磨配制成100 ml，4℃冰箱保存备用。

1.3 动物处理方法

正常组为假手术组对照。其他三组采用Hulth法[3]建立大鼠膝OA模型。术中注意避免损伤关节面软骨。术后大腿外侧肌注青霉素8万U，连续3 d。术后第二天，动物饮食饮水正常，跛行，伤口无感染。术后第3天开始，每日驱赶30 min，持续驱赶2 m。而后对应组灌胃给药，喂药3月后处死大鼠，取出患侧关节软骨进行检测。实验期间不限制饮食，允许其在笼内自由活动。

1.4 实验步骤

1.4.1电泳：取适量RIPA裂解液匀浆组织，测蛋白浓度后，各样品取50 ug总蛋白上样电泳，根据蛋白分子量配制12%的PAGE胶电泳。根据预染marker显示，判断目的蛋白得到充分分离后，停止电泳。

1.4.2转膜(湿转法)：取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。转膜条件：p38-200 mA，100 min。

1.4.3封闭：用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。

1.4.4一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。p38-1∶400稀释。

1.4.5二抗：TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5 min/次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗-1∶80 000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。

1.4.6显色曝光：TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5 min/次。每张膜滴加适量的底物液，孵育数分钟。待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后放入显影液显影、定影液定影。

1.4 观察指标

观察膝骨关节炎大鼠P38表达变化。

1.5 实验数据处理

应用SPSS 12.0版统计软件(SPSS INC)统计学处理，单因素方差分析。

2 结果

试验结果显示，p38 MAPK 磷酸化产物在模型组持续表达，而在健骨方组的 p38 MAPK 磷酸化产物的表达呈下降趋势，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 健骨方对各组膝骨关节炎大鼠P-38表达的影响Table 1 The effect of Jiangu recipe on expression of p38 MAPK in knee osteoarthritis rats

注：模型组与正常组比较，给药组与模型组比较*P<0.05
Ps：Compared Model group with normal group，compared Dose group with normal group*(P<0.05)

图1 不同组别大鼠P-38的表达结果(western)Fig.1 The result of p38 MAPK expression in rats

3 讨论

1995年,在国际骨性关节炎专题会议上提出了骨性关节炎的最新定义[4],即骨性关节炎是在力学因素和生物学因素的共同作用下,软骨细胞、软骨基质及软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡的结果。骨性关节炎的发病基础来自软骨的损伤,关节软骨损伤是启动骨性关节炎的首要因素。炎症介质、基质和机械应力通过软骨特定的受体,转导这些信号到细胞核,启动基质分解酶和炎性基因,但目前骨性关节炎具体发病机制尚还没有很充分的阐明，本课题主要认为OA发病过程中起主要作用的炎性介质IL-1β和TNF-α通过激活关节软骨p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路转导途径来发挥作用[11,12]，健骨方中的有效成分能够减少P38的表达从而保护膝关节软骨。

p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号转导通路广泛存在真核细胞内的应激活化蛋白激酶,是细胞外引起细胞核内反应的通道之一。此信号通路在炎症反应(软骨炎性细胞因子的产生)、细胞的生长分化(软骨细胞表型的保持和分化，软骨细胞的肥大化、钙化、凋亡以及软骨基质金属蛋白酶的合成)过程中具有重要作用，在OA的发病中扮演着重要的角色[5，7，10]。p38信号通路在关节软骨的破坏中可能处于一个枢纽地位，阻断或减少p38的表达会对软骨起到保护作用[9]。

p38可分为p38α、p38β、p38γ和p38δ等4种，在各种组织中的含量不一。一般所说的p38即是指p38α，普遍存在于各种组织中[8]。p38静息状态主要散在分布于细胞浆，炎症信号激活后转移至细胞核内[6]，从而启动基质分解酶和炎性基因。被炎性介质IL-1β和TNF-α激活后能再通过调节激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)转录因子调节MMPs的表达，激活MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-9的活性，加速胶原的病理性降解[13，14,15]，从而造成关节软骨损伤。综上所述，在OA发病早期，受损的软骨细胞在周围炎症因子的作用下激活p38的表达，p38被炎症因子激活后通过调节激活蛋白-1转录因子调节MMPs的表达，MMPs降解软骨基质，使关节软骨的完整性破坏，削弱软骨抵抗外界机械应力的能力，造成恶性循环使软骨细胞更易暴露于众多炎性因子的攻击之下，使软骨基质成分游离出软骨，软骨破坏，最终导致软骨质量不断下降和进行性退化，因而通过影响p38 MAPK的表达，从而对软骨细胞退变起到干预作用。

本实验结果表明，中药复方健骨方能有效影响p38 MAPK表达水平，从以上研究结果可以看出，膝骨关节炎的发病与p38MAPK介导的细胞信号通路密切相关，通过在信号通路水平干预和调控p38MAPK的表达和活性，将有希望成为治疗膝骨关节炎的有效途径。此外，健骨方治疗膝骨关节炎的机制与调节p38MAPK这一细胞信号转导通路密切相关。中药复方健骨方是李同生教授经过多年临床实践，治疗寒热骨痹、治虚治实、治气治血等多功效和双相作用。

本研究通过研究健骨方影响p38MAPK信号传导通路，阐明健骨方治疗膝骨关节炎的疗效与机制，为临床更加合理有效的治疗膝骨关节炎提供了理论依据。