宫内七氟醚暴露对仔鼠海马CA1区caspase-3表达及早期认知功能的影响

陈 弦 万海方 范 皓 陶 凡

宫内七氟醚暴露对仔鼠海马CA1区caspase-3表达及早期认知功能的影响

陈 弦 万海方 范 皓 陶 凡

目的研究宫内暴露于七氟醚对仔鼠海马CA1区神经元凋亡及早期认知功能的影响。方法成年性成熟Wistar雌鼠交配妊娠后取孕鼠8只，随机分为对照组七氟醚组，每组4只。七氟醚组于孕19天时暴露于2.4%七氟醚6h，对照组不给予任何药物。应用免疫组化法观察两组仔鼠在出生后第1天（PN1）、第14天（PN14）、第21天（PN21）海马CA1区caspase-3的表达情况。出生后32～37天对仔鼠进行Morris水迷宫实验以测定其认知功能。结果出生后第1天，七氟醚组仔鼠海马CA1区caspase-3总光密度值（IOD）明显高于对照组仔鼠[（60309.6±6403.6）比（17680.5± 9326.7），P＜0.05]，出生后第14、21天，七氟醚组仔鼠海马CA1区caspase-3总光密度值与对照组仔鼠相比，差异无统计学意义[（3213.7±582.8）象素比（8503.2±2402.5）象素，（2046.0±62.7）象素比（4839.9±716.3）象素，P＞0.05]。七氟醚组仔鼠逃避潜伏期与对照组仔鼠相比，差异无统计学意义[（80.0±13.5）s比（80.7±19.1）s，（52.2±10.3）s比（41.0±19.7）s，（29.2±11.4）s比（28.5±15.3）s，（22.0±5.5）s比（19.2±6.7）s，（16.2±2.8）s比（20.3±4.8）s，P＞0.05]，七氟醚组仔鼠穿越目标象限次数与对照组仔鼠相比无统计学差异[（8.3±0.8）次比（8.2±3.0）次，P＞0.05]。结论孕晚期Wistar母鼠暴露于2.4%七氟醚对仔鼠海马CA1区神经元发育的影响呈“一过性损伤”，并不会引起子代早期认知功能异常。

仔鼠；七氟醚；海马CA1区；认知功能；caspase-3；水迷宫

KEY WORDS offspring;sevoflurane;the CA1 region of hippocampus;cognitive function;caspase-3;Morris water maze

随着二胎政策普遍开放，疤痕子宫妊娠、高龄产妇、妊娠期合并严重并发症等产妇数量越来越多。在某些紧急状况下，如胎儿急性窘迫，胎盘早剥大出血、凝血功能障碍等，产妇需在全身麻醉下行紧急剖宫产术。七氟醚属于新型的卤素类吸入麻醉剂，因其诱导迅速、刺激性小、血液溶解度低，代谢快等优势而广泛用于全身麻醉。实验研究发现吸入麻醉剂导致神经变性的特性具有剂量依赖性[1]，因此了解孕期手术常用的吸入麻醉浓度是否会导致胎儿大脑神经变性十分重要。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组成年性成熟雌性Wistar大鼠16只，体质量180～210g，成年性成熟雄性Wistar大鼠8只，体质量300g，由浙江中医药大学动物中心提供,动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。雌雄大鼠合笼交配。应用托盘阴栓检查法于次日早晨观察托盘中是否有阴栓，发现阴栓当天记为受孕第0日。怀孕雌鼠共8只，采用随机数字表法分为七氟醚组和对照组，每组4只。七氟醚组于孕19天时吸入2.4%七氟醚6h，对照组不给予任何药物。

1.2 自制麻醉箱将七氟醚组孕鼠于孕19天放入20cm×12cm×10cm自制小盒内，在盒的两侧各有一小孔，一端接小动物麻醉机（浙江中医药大学动物中心提供），七氟醚浓度2.4%，持续时间6h。另一端为出气端，接废气吸收罐以吸收CO2等。将孕鼠置于空气条件下自然苏醒。

1.3 组织切片制备孕鼠自然分娩，七氟醚组和对照组仔鼠中分别取出生后第1（Postnatal Day 1，PN1）、14（PN14）、21（PN21）天仔鼠各6只，断头取脑，固定于10%中性甲醛溶液中72h。切取包含海马部位的脑组织块，进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行冠状位连续切片，片厚约4μm。

1.4 免疫组化染色（1）具体步骤：切片置60℃烤箱烘烤2h；切片脱蜡至水；蒸馏水洗2min；高压热修复：高压锅内放适量自来水，将修复液倒入烧杯内，将烧杯置于高压锅内煮沸，将切片放入装有修复液的烧杯内，盖紧高压锅，加热至设定压力冒气后持续2min，自来水冷却；3%H2O2溶液阻断过氧化物酶，10min；PBS洗5min×3次；滴加一抗，4℃冰箱过夜；PBS洗5min×3次；滴加二抗，37℃孵育15min；PBS洗5min×3次；DAB显色1～2min；复染、透明后封片。（试剂盒由santa cruz公司提供，批号15383803）。（2）图像分析：Nikon eclipse 80i显微镜（Nikon公司）下观察，400倍光镜下观察细胞内出现棕黄色颗粒为caspase-3阳性细胞，用显微镜下拍摄照片，采用Carl Zeiss Imaging Systems图象分析软件（Carl Zeiss公司）计算总光密度，以反映caspase-3的表达情况。

1.5 Morris水迷宫实验两组分别选取6只仔鼠，于出生后32～37天进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫由一个直径120cm，高50cm的圆形水池构成，水池内壁为黑色，水池划分为4个象限，每个象限设置入水点标记，于第4象限内放置直径12cm，高29cm的透明平台，槽内水深30cm，使平台没于水下1cm，水温控制在23～25℃，水池上方安装自动摄像系统[2]。在前5天的定位航行实验中，各组仔鼠每日训练3次，每次间隔1h。将仔鼠分别从第1、2、3象限的入水点面向池壁放入水中。记录仔鼠在120s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期），超过120s未能找到平台者，记为120s，所有仔鼠均在平台上停留10s。取每天3次训练的平均值为当天的逃避潜伏期；在第6天的空间探索实验中，撤去平台，将仔鼠从距离目标象限最远处面向池壁放入水中，计数仔鼠在1min内穿越目标象限的次数。

1.6 统计学方法应用SPSS17.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s） 表示。采用两独立样本t检验：先进行方差方程的Levene检验，若方差齐，采用t检验；若组间方差不齐，采用近似t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下仔鼠海马CA1区caspase-3阳性细胞表达情况的观察出生后第1天，七氟醚组仔鼠CA1区的神经元可见大量棕黄色颗粒弥散分布在胞浆内，着色深，细胞失去正常形态，胞体增大呈多边形；对照组仔鼠CA1区的神经元可见少量棕黄色颗粒，着色浅，细胞形态未见明显改变。出生后第14天及21天，两组仔鼠CA1区的神经元胞浆无明显着色，细胞形态未见明显改变。

2.2 两组仔鼠海马CA1区caspase-3阳性表达出生后第1天，七氟醚组仔鼠海马CA1区caspase-3阳性表达强于C组仔鼠（P＜0.05）；出生后第14天及第21天，两组仔鼠海马组织caspase-3阳性表达无明显差异（P＞0.05）。见表1，图1～2（封三）。

表1 仔鼠海马组织caspase-3蛋白总光密度值比较（象素，x±s）

2.3 两组仔鼠逃避潜伏期、穿越目标象限次数的比较两组仔鼠逃避潜伏期、穿越目标象限次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3 讨论

结合预实验结果及文献资料，本实验选择2.4%（=1MAC）[3]七氟醚吸入6h作用于孕鼠，观察此浓度对仔鼠大脑神经元发育可能存在的影响。

大鼠的突触发生期主要是在出生前一两天至出生后2周[4]，有研究[5-6]认为，此期接触七氟醚会影响仔鼠突触形成导致神经发育受损。本实验选择在孕晚期突触形成阶段作为研究对象，观察在神经发育高峰期吸入七氟醚是否对噬齿类动物子代大脑神经发育造成影响。

Caspase是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶，其中Caspase-3是细胞凋亡的执行因子[7]，常用于检测早期凋亡。海马CA1区与记忆、学习密切相关，是药物导致中枢神经系统毒性的敏感区域，易受麻醉剂影响而出现神经变性[8]。研究[9]表明，七氟醚可激活caspase-3引起细胞凋亡。在本实验中，孕19天仔鼠海马CA1区的神经细胞在出生后第1天凋亡明显，随时间延长，其神经细胞凋亡情况明显好转，出生后第14天、21天七氟醚组仔鼠caspase-3总光密度值与对照组仔鼠无明显差异。提示，孕晚期吸入七氟醚对仔鼠海马CA1区神经元的损伤或许仅为一过性损伤，并不持续到远期。

Morris水迷宫是评价海马依赖的空间参考记忆的主要行为学实验方法之一[10]。海马区神经元损伤会影响空间任务的完成。在出生后32～37天间，各组仔鼠的逃避潜伏期随训练天数增加逐渐缩短，而孕19天组仔鼠与对照组仔鼠在每一天训练中逃避潜伏期时间均无明显差异，提示孕晚期吸入七氟醚并未对仔鼠早期的学习能力造成影响。空间探索实验反映仔鼠的记忆能力，两组仔鼠在穿越目标象限次数上并无统计学差异，提示孕晚期吸入七氟醚并不会降低仔鼠的空间记忆能力。

有研究发现，新生大鼠吸入七氟醚会导致其学习记忆功能降低[11-12]。出生后2周内及出生前1～2天均属于突触发育期，而本实验结果提示，孕19天母鼠吸入七氟醚并不会导致仔鼠学习记忆能力下降。考虑原因可能为胎盘屏障对七氟醚扩散入胎鼠体内有部分阻碍作用，因此实际作用于胎鼠的七氟醚浓度较低，使得仔鼠海马CA1区神经元损伤仅为一过性，然而具体机制仍需进一步实验研究来完善。

综上所述，孕晚期母体暴露于2.4%七氟醚可引起仔鼠海马CA1区神经元“一过性损伤”，但不会引起子代早期的认知功能障碍。

表2 两组仔鼠逃避潜伏期（PN32-26）、穿越目标象限次数（PN37）比较（s，x±s）

［1］Wei H，Liang G，Yang H，et al.The common inhalational anesthetic isoflurane induces apoptosis via activation of inositol 1，4，5-trisphosphate receptors［J］.Anesthesiology，2008，108（2）：251-260.

［2］罗小泉，骆利平，陈海芳，等.Morris水迷宫检测大鼠记忆力方法的探讨［J］.时珍国医国药，2010，21（10）：2667-2669.

［3］Obal D，Preckel B，Scharbatke H，et al.One MAC of sevoflurane provides protection against reperfusion injury in the rat heart in vivo［J］.Br J Anaesth，2001，87（6）：905-911.

［4］Zou X，Patterson TA，Sadovova N，et al.Potential neurotoxicity of ketamine in the developing rat brain［J］.Toxicol Sci，2009，108（1）：149-158.

［5］Amrock LG，Starner ML，Murphy KL，et al.Long-term effects of single or multiple neonatal sevoflurane exposures on rathippocampal ultrastructure［J］.Anesthesiology，2015，122（1）：87-95.

［6］Kato R，Tachibana K，Nishimoto N，et al.Neonatal exposure tosevofluranecausessignificantsuppressionofhippocampal long-term potentiation in postgrowth rats［J］.Anesth Analg，2013，117（6）：1429-1435.

［7］Stennicke H R，Salvesen G S.Properties of caspase［J］. Biochim Biophys Acta，1998，1387（1-2）：17-31.

［8］Li Y，Liang G，Wang S，et al.Effects of fetal exposure toisoflurane on postnatal memory and learning in rats［J］. Neuropharmacology，2007，53（8）：942-950.

［9］Yuanlin Dong，Guohua Zhang，Bin Zhang，et al.The Common Inhalational Anesthetic Sevoflurane Induces Apoptosis and Increases β-Amyloid Protein Levels［J］.Arch Neurol，2009，66（5）：620-631.

［10］Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1（2）：848-858.

［11］谢娟，孙建良，孔飞娟，等.不同浓度七氟醚麻醉对新生大鼠认知功能的影响［J］.中华麻醉学杂志，2013，33（8）：948-950.

［12］王来，薛庆生，罗艳，等.不同浓度七氟醚麻醉对新生大鼠远期学习记忆能力的影响［J］.中华麻醉学杂志，2013，33（2）：191-193.

（收稿：2016-07-20修回：2016-10-18）

Effect of Sevoflurane Exposure in the Uterus on Rat Offspring's Caspase-3 Expression in the CA1 Region of Hippocampus and the Early Cognitive Function

CHEN Xian,WAN Haifang,FAN Hao,TAO Fan.Department of Anesthesiology,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003)，China

Objective To investigate the effect of sevoflurane exposure in the uterus on the rat offspring's brain neural apoptosis in the CA1 region of hippocampus and the cognitive function at early age.M ethods Eight adult female Wistar rats got pregnant.With the random number table method,pregnant rats were divided into 2 groups：control group and sevoflurane group,with 4 rats in each group.Rats in sevoflurane group were exposed to 2.4%sevoflurane for 6 h on the gestational 19th day and rats in control group were fed in the same condition in the absence of sevoflurane.The expression of caspase-3 in the CA1 region of hippocampus on PN,PN14 and PN21 were determined by immunohistochemistry.The early cognitive function of the offspring from PN32 to PN37 was tested by Morris water maze test.Results Compared to the offspring of control group,the offspring of sevoflu rane group had higher integral optical density（IOD）of caspase-3 in the CA1 region of hippocampus on PN1（60309.6±6403.6 vs 17680.5±9326.7,P＜0.05）and similar IOD on PN14 and PN21（PN14：3213.7±582.8 vs 8503.2± 2402.5;PN21：2046.0±62.7 vs 4839.9±716.3;all P＞0.05）.No significant differences in escape latency（80.0±13.5s vs 80.7±19.1s,52.2±10.3s vs 41.0±19.7s,29.2±11.4s vs 28.5±15.3s,22.0±5.5s vs 19.2±6.7s,16.2±2.8s vs 20.3±4.8s）and explored number in the target quadrant（8.3±0.8 times vs 8.2±3.0 times）were noted between control group and sevoflurane group（all P＞0.05）.Conclusion The expose to 2.4%sevoflurane during late pregnancy causes temporary injury to brain neural development in the CA1 region of hippocampus of rat offspring.It has no significant effect on the cognitive function of the rats at the early age.

杭州市卫生科技计划项目（No.2012A044）

杭州市红十字会医院麻醉科（杭州310003）

陶凡，Tel：15867199018；E-mail：461226058@qq.com