瑞士乳杆菌AJT产细菌素的发酵条件优化

赵娜，刘鑫，周利娟，白晓晔，王荣平，乌云达来，*（.包头市农畜产品质量安全监督管理中心，内蒙古包头0400；.江苏汉邦科技有限公司，江苏南京005；.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特0008）

瑞士乳杆菌AJT产细菌素的发酵条件优化

赵娜1，刘鑫1，周利娟2，白晓晔3，王荣平3，乌云达来3，*
（1.包头市农畜产品质量安全监督管理中心，内蒙古包头014010；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏南京223005；3.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特010018）

瑞士乳杆菌AJT是一株广谱抗菌活性菌株，对革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌和真菌均有较好的抑制作用。通过优化试验确定其最优的培养基成分为：乳糖15.0 g/L、酵母浸出粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L、乙酸钠7.0g/L、柠檬酸钠7.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁200 mg/L、硫酸锰40 mg/L，吐温-80 1.0 g/L，起始pH6.5；最佳培养条件：接种量2.0%，37℃培养20h。与未优化发酵条件相比，粗提取的瑞士乳杆菌AJT细菌素对蜡状芽孢杆菌的抗菌活性提高了53.8%，对黄色镰孢的抗菌活性提高了41.5%，对大肠杆菌的抗菌活性提高了68%。

瑞士乳杆菌；细菌素；发酵条件；优化

乳酸菌素（Bacteriocins of LAB）指由乳酸菌产生的具有抗菌活性的多肽或前体多肽。因其安全、无毒、抗菌性能稳定等特性，成为防腐剂开发的热点［1］。做为国内外公认的人用益生乳杆菌之一，瑞士乳杆菌有较强的保健功能［2］。目前对其研究大部分集中在利用发酵特性开发乳制品及生产功能性多肽方面，对其细菌素研究报道相对较少。国外已报道的瑞士乳杆菌抗菌物质有瑞士乳杆菌G51细菌素、瑞士乳杆菌素27、瑞士乳杆菌细菌素V1829、瑞士乳杆菌CNRZ450抗菌物质和Helveticin J等，其中研究最为深入的是瑞士乳杆菌481产生的Helveticin J，已展开对该细菌素的编码基因的研究［3］。国内仅对瑞士乳杆菌细菌素HF08的研究较为深入，正在探索其抑菌有效成分和机理［4］。

经过逐步纯化的菌株AJT细菌素，对蜡状芽孢杆菌等革兰氏阳性菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌和黄色镰孢等真菌均具有较强抑制作用，是广谱抗菌活性细菌素［5］。本文通过单因素和正交试验，确定了瑞士乳杆菌AJT产细菌素的最佳发酵条件，大大提高了细菌素的产量和活性，为其开发应用提供理论数据。

1　材料与方法

1.1菌株与培养基

菌株：瑞士乳杆菌AJT，从内蒙古地区酸马奶中分离；大肠杆菌ACCC10145、蜡状芽孢杆菌AS1.1688、黄色镰孢ACCC32249，内蒙古农业大学食品质量与安全实验室保藏菌株。

培养基：脱脂乳培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、LB培养基、NB培养基、MRS培养基、TPY培养基、PDA培养基、NYD培养基、Landy培养基、BPY培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，按文献［6］方法配制。

1.2主要仪器

ZHJH-C1214C超净工作台：上海智城公司；PB-10 pH计：Sartorius集团；DHP-9082电热恒温培养箱：上海恒科公司；PL303电子天平：Mettler Toledo公司；CX31RTSF光学显微镜：OLYMPUS公司。

1.3方法

1.3.1瑞士乳杆菌AJT活化

将保存的菌株在脱脂乳培养基中活化2代后，MRS液体培养基活化3代。

1.3.2无菌上清液制备和细菌素粗提取

瑞士乳杆菌AJT接种于MRS液体培养基，37℃培养，发酵液经8 000 r/min离心10 min，收集上清液并经0.45 μm孔径滤菌器滤菌，得无菌上清液。取无菌上清液200 mL，60℃浓缩20 min，至50 mL左右。用乙酸乙酯摇瓶萃取过夜后静置6 h取上层液体浓缩干燥，甲醇抽提2次。8 000 r/min离心10 min，上清液浓缩干燥后，用灭菌蒸馏水溶解，经0.45 μm孔径滤菌器滤菌后即为粗提取的瑞士乳杆菌AJT细菌素。

1.3.3指示菌培养

将指示用细菌接种于营养琼脂斜面培养基，37℃培养20 h左右（藤黄微球菌30℃培养）；将接种于PDA斜面培养基的霉菌，在28℃条件下培养5 d～7 d。

1.3.4指示平板制备

用20 mL灭菌生理盐水洗脱在斜面培养基上生长的细菌，制成OD600 nm为0.5的菌悬液，按10%体积比将菌悬液混入冷却至55℃的营养琼脂培养基，摇匀后倾注平皿；用20 mL灭菌生理盐水洗脱在PDA斜面培养基上生长的霉菌，制成菌悬液，按10%体积比将菌悬液混入冷却至55℃的PDA培养基，倾注平皿。

1.3.5瑞士乳杆菌AJT产细菌素最适培养基的筛选

将瑞士乳杆菌AJT分别按2.0%接种量接种于1.1培养基中，37℃培养36 h，做牛津杯抑菌试验。

1.3.6最佳培养时间确定

将瑞士乳杆菌AJT按体积比2.0%接种于MRS液体培养基，每隔2 h测定其OD600nm和pH。以大肠杆菌为指示菌，做牛津杯法抑菌试验，确定不同培养时间菌株AJT的无菌上清液的抗菌活性。

1.3.7最佳接种量确定

分别以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%接种量（体积分数）将瑞士乳杆菌AJT接种于MRS液体培养基中，通过牛津杯法抑菌试验，测定不同接种量时发酵上清液的抑菌活性。

1.3.8最佳培养温度确定

将瑞士乳杆菌AJT按体积比2.0%接种量接种于MRS液体培养基中，分别在31、34、37、40、43℃条件下培养20 h，通过牛津杯法抑菌试验，测定不同培养温度下发酵上清液的抑菌活性。

1.3.9起始pH确定

用1.0 mol/L HCl和2.0 mol/L NaOH将MRS液体培养基起始pH分别调节至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。按2.0%体积比接入瑞士乳杆菌AJT后37℃培养20 h，取无菌上清液，做抑菌试验。

1.3.10碳源、氮源优化

通过API 50 CHL糖发酵试验，发现菌株AJT能够利用的糖为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-乳糖、N-乙酰葡萄糖酰胺和D-半乳糖［7］。D-甘露糖和N-乙酰葡萄糖酰胺价格较贵，生产成本大，故用乳糖、半乳糖、葡萄糖做为MRS培养基的碳源。按20.0 g/L的添加量分别加入3种糖（其他成分不变），设置对照组。按2.0%（体积分数）接种量接入瑞士乳杆菌AJT，取培养20 h的无菌上清液，做牛津杯抑菌试验。

分别以牛肉浸膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、大豆分离蛋白、硝酸铵和尿素作为氮源，配制MRS液体培养基（其他成分不变），设置对照组。按体积比2.0%接入瑞士乳杆菌AJT，培养20 h后取无菌上清液做抑菌试验，确定氮源种类。

按正交试验设计（表1）配制培养基，分别取上清液做抑菌试验，确定最佳碳源、氮源种类。

1.3.11无机盐含量确定

对培养基中缓冲盐乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钾配比优化的正交试验设计如表2。

取不同培养基的发酵上清液做抑菌试验，确定乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钾的最佳配比。

1.3.12金属离子含量确定

按0、100、200、300、400、500、600、700、800mg/L的Mg2+（MgSO4）添加量配制MRS培养基（已优化的成分按优化后的量添加），2.0%（体积分数）接种量接入瑞士乳杆菌AJT，培养20 h后做抑菌试验。

按 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/mL分别在优化的MRS液体培养基中加入Mn2+。按2.0%（体积分数）接种量接入瑞士乳杆菌AJT，培养20 h后做抑菌试验。

1.3.13吐温-80含量确定

配制不同浓度Tween-80的MRS液体培养基，添加量分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L，起始pH6.5、37℃培养20 h后做抑菌试验。

1.3.14优化结果验证

按优化后配方配制MRS液体培养基，起始pH6.5，接种量2.0%，37℃培养20 h，以未优化的MRS液体培养基做为对照，取无菌上清液做牛津杯法抑菌试验。

表1C∶N优化因素水平表Table 1　Factors and levels of carbohydrate：nitrogen source

表2　无机盐含量优化因素水平表Table 2　Factors and levels of inorganic salts

2　结果与分析

2.1瑞士乳杆菌AJT抗菌物质最适培养基筛选

在不同培养基中培养36 h的瑞士乳杆菌抗菌物质的抑菌结果见表3。

菌株AJT在MRS、TPY、PDA、Landy和BPY培养基中培养的无菌上清液具有抗菌活性，其中MRS发酵上清液抗菌活性最强。因此确定MRS培养基为最适培养基。

表3　不同种类培养基对抗菌能力的影响Table 3　The influence of different medium to the bacteriocin antimicrobial activity

2.2最佳培养时间

瑞士乳杆菌AJT发酵上清液抗菌趋势如图1，培养20 h的发酵上清液的抗菌活性最强。

图1 菌株AJT生长曲线及抑菌活性Fig.1　Growth and bacteriostatic activity curves of strain AJT

2.3最适接种量

接种量对抗菌能力的影响见表4。

表4 接种量对抗菌能力的影响Table 4　Effect of inoculum size on the antimicrobial activity of strain AJT

结果表明：接种量为2.0%（体积分数），培养时间为20 h的瑞士乳杆菌AJT细菌素的抗菌活性最强。

2.4最适培养温度

培养温度对对抗菌能力的影响见表5。

培养温度试验结果表明，37℃培养时最利于抗菌物质的产生，上清液抑菌圈直径大于23.0 mm。

表5 培养温度对抗菌能力的影响Table 5　Effect of culture temperature on the bacteriocin antimicrobial activity

2.5最适起始pH

培养基起始pH不但影响乳酸菌的生长，而且影响细菌素的产量和活性［8］。为确定瑞士乳杆菌AJT产细菌素的最佳起始pH，分别将菌株接种于不同起始pH的培养基中，结果表明：在pH4.5～6.5间，随着起始pH的增加，发酵上清液抗菌活性逐渐增加，在pH6.5时活性达到最高；之后不断下降，且在pH8.5时完全丧失抗菌活性。最终确定瑞士乳杆菌AJT产细菌素的起始pH为6.5。

乳酸菌生长的pH是影响细菌素抗菌能力和胞外产量的重要因素，不同种类的乳酸菌素所要求的起始pH不同，因此确定产细菌素乳酸菌最佳起始pH具有重要意义。早在1997年，已经证明细菌素和靶细胞膜的亲和力跟pH有关，如把pH从7.5降低到6.0，能够增加细菌素PA-1与膜的结合力和渗透入细胞的能力［9］；起始pH还会影响细菌素向细胞外的分泌，如Parvez等通过实验发现，将产Nisin的乳酸菌的生长pH调节为6.7，此时合成的Nisin就会留在细胞内［10］。

2.6碳源、氮源优化

与乳酸菌素产量关系最密切的糖类为葡萄糖和乳糖两种，有报道称葡萄糖对乳酸菌素的产生具有促进作用，如葡萄糖作为碳源能够提高乳酸菌IO-1产生的Nisin Z的抗菌活力［8］，也能够提高片球菌素AcH的抗菌效果。但有报道称葡萄糖是乳酸菌增值的最佳碳源，乳糖是提高抗菌物质活性和产量的最佳碳源［11］。本文通过对多种糖的筛选，最终发现以乳糖作为碳源时，能够大幅提高菌株AJT的抗菌活力。

试验表明在一定范围内，Nisin的产量与氮的含量成正比［12］。因此，确定培养基中N源的含量对乳酸菌素产量的提高具有重要意义。通过不同种类有机氮、无机氮对菌株AJT生长及抗菌物质活性影响的试验，发现以有机氮源酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏作为唯一N源时能够产生抗菌物质，故以乳糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏作为碳、氮来源并做正交试验，结果见表6和图2。

表6　碳源、氮源正交试验Table 6　Results of orthogonal test of carbohydrate and nitrogen source

图2　因素总评分和极差对比Fig.2　Total scores of factors and comparison on ranges of factors

以乳糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏做碳源、氮源优化的L16（45）试验设计，结果如下：

1）16组正交试验反应的结果为，第8组A2B4C3D2（乳糖15.0 g/L、酵母粉7.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸膏8.0 g/L）培养基培养的瑞士乳杆菌AJT，其无菌上清液的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到26.70 mm，第6 组A2B2C1D4和第10组A3B2C4D3培养的菌株AJT的抑菌效果居次位，抑菌圈直径为25.80 mm。

2）通过因素评分对比和极差分析，发现碳源、氮源对菌株AJT抗菌物质活性的影响依次为：A（乳糖）＞B（酵母粉）=C（胰蛋白胨）＞D（牛肉浸膏）。菌株AJT抗菌物质活性最强的碳源、氮源组合为A2B4C1D4（乳糖15.0 g/L、酵母粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L），与16组正交试验结果不一致。

为验证抗菌活性最强的碳源、氮源配比，对A2B4C1D4和A2B4C3D2两个组合进行对比试验。发现最佳配比组无菌上清液的抑菌效果优于正交试验第8组，最终确定瑞士乳杆菌AJT抗菌物质产生的最优碳源、氮源分别为：乳糖15.0 g/L、酵母粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L。

2.7无机盐含量确定

对乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钾的正交优化结果见表7和图3。

表7　无机盐正交试验Table 7　Results of orthogonal test of inorganic salts

图3　因素总评分和极差对比Fig.3　Total scores of factors and comparison on ranges of factors

由表7和图3可知：

1）无菌上清液抑菌效果最佳的试验组为表7的第9组试验组合（A3B3C2），即乙酸钠7.0 g/L、柠檬酸钠7.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L。

2）因素评分和极差对比分析表明，影响菌株AJT抗菌物质产生的3种无机盐主次关系为：A（乙酸钠）＞C（磷酸氢二钾）＞B（柠檬酸钠）。上清液抑菌效果最优的缓冲盐配比为A3B3C2，与第9组试验一致。故菌株AJT抗菌物质活性最强的无机盐配比为乙酸钠7.0 g/L、柠檬酸钠7.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L。

2.8金属离子含量确定

Mg2+和Mn2+对菌株AJT上清液抗菌活力的影响见图4，当MgSO4添加量为200 mg/L、MnSO4添加量为40 mg/L时，最利于抗菌物质的产生。

图4Mg2+、Mn2+对抗菌能力的影响Fig.4　Effect of Mg2+and Mn2+on the bacteriocin antimicrobial activity

2.9吐温-80含量确定

不同吐温-80含量对菌株AJT抗菌活性的影响见图5。

图5 吐温-80对抗菌能力的影响Fig.5　Effect of tween-80 on the bacteriocin antimicrobial activity

含量为1.0 g/L时抗菌活性最强，之后作用不明显，故确定吐温-80的含量为1.0 g/L。与报道的吐温-80能够明显提高一些细菌素产量吻合［9］。

2.10优化结果验证

通过对瑞士乳杆菌AJT培养基的优化，结果如图6所示。

图6优化结果验证Fig.6　The result of fermentation condition optimization

粗提取的细菌素对蜡状芽孢杆菌的抑制能力提高53.8%，对黄色镰孢的抑制能力提高41.5%，对大肠杆菌的抑制能力提高68.0%。

3　结论

乳酸菌细菌素的产生与培养基营养成分的种类和含量关系密切［13］，优化培养基成分对乳酸菌素活性具有重要意义。本文通过对各成分的优化，确定了菌株AJT产细菌素的培养基成分：乳糖15.0 g/L、酵母浸出粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L、乙酸钠7.0 g/L、柠檬酸钠7.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、MgSO4200 mg/L、MnSO440 mg/L，吐温-80 1.0 g/L；培养条件：起始pH6.5，接种量2.0%，37℃培养20 h。

与未优化发酵条件相比，粗提取的瑞士乳杆菌AJT细菌素对蜡状芽孢杆菌的抗菌活性提高53.8%，对黄色镰孢的抗菌活性提高41.5%，对大肠杆菌的抗菌活性提高68%，由此说明，优化试验对菌株AJT细菌素的产量和活性提高具有显著作用，对瑞士乳杆菌AJT抗菌物质的工业化开发、应用具有重要意义。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production by Lactobacillus helveticus AJT

ZHAO Na1，LIU Xin1，ZHOU Li-juan2，BAI Xiao-ye3，WANG Rong-ping3，Wuyundalai3，*
（1.Baotou Livestock Products Quality and Security Supervisin and Management Center，Baotou 014010，Inner Mongolia，China；2.Jiangsu Hanbang Technology CO.，LTD，Nanjing 223005，Jiangsu，China；3.College of Food Science and Engineering，Inner Monglia Agricultural University，Hohhot 010018，Inner Mongolia，China）

Lactobacillus helveticus AJT is a broad antibacterial lactobacillus has strong antibacterial activity against Gram-positive，Gram-negative and fungi strains.Single factor and orthogonal tests were conducted to de termine the media for optimum antibacterial activity culture，and the optimized ingredient was：lactose 15.0 g/L，yeast extract 7.0 g/L，peptone 6.0 g/L，beef extract 12.0 g/L，sodium citrate hydrate 7.0 g/L，sodium acetate 7.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，MnSO4·5H2O 40 mg/L and tween-80 1.0 g/L，with initial pH at 6.5，the optimum incubation parameters were incubated at 37℃for 20 h with 2%（volume fraction）concentration.Its antibacterial activity of the extract increased 53.8%，41.5%and 68%acting on Bacillus cereus ，Fusarium culmorum and Escherichia coli respectively compared to the unoptimized fermentation condition.

Lactobacillus helveticus；bacteriocin；fermentation condition；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.043

内蒙古自治区应用技术研发资金计划项目（20130438）；内蒙古自然科学基金面上项目（2014MS0358）

赵娜（1988—），女（汉），助理工程师，硕士，研究方向：农畜产品质量安全。
*

乌云达来（1975—），男，副教授，研究方向：益生菌研究与开发。

2015-06-06