UPLC-MS/MS法测定鱼肉中硝基呋喃代谢物残留量

周贻兵，吴坤，李磊，林野，刘利亚，*（.贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004；.贵州师范学院，贵州贵阳55008）

UPLC-MS/MS法测定鱼肉中硝基呋喃代谢物残留量

周贻兵1，吴坤2，李磊1，林野1，刘利亚1，*
（1.贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004；2.贵州师范学院，贵州贵阳550018）

采用超高效液相色谱－串联质谱法测定鱼肉中AHD、AMOZ、AOZ、SEM残留。样品经盐酸水解，与2-NB在37℃水浴中衍生16 h后，离心，加入0.5 mol/L磷酸氢二钾2 mL，用氢氧化钠调节pH至7.1～7.5之间，乙酸乙酯萃取，氮吹，流动相定容。采用电喷雾MRM正离子模式扫描，内标法定量。4种代谢物在2.5μg/kg～50μg/kg的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数大于0.999 3，最低检出限为0.2 μg/kg。在样品中加入（1、10、20 μg/kg）3个浓度水平，平均回收率83.0%～101%之间，相对标准偏差（RSDn=6）在4.2%～11.3%之间。使用同位素内标法定量，校正了衍生不完全、光照分解、溶液pH对提取效率的影响，提高了定量结果的准确性，适用于鱼肉中4种硝基呋喃代谢物的确证。

硝基呋喃代谢物；鱼；超高效液相色谱－串联质谱法

硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗生素，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因。因低浓度抑菌，高浓度杀菌的作用，被广泛用于饲料添加剂来预防和治疗沙门菌或大肠杆菌等引起的疾病。后来研究发现，硝基呋喃类药物及其代谢物在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类。呋喃唑酮及其代谢物具有致突变、致癌作用［1］。硝基呋喃类化合物是直接致变剂，无需外源性激活系统就可引起细胞突变。硝基呋喃类抗生素具有对光敏感、代谢快的特点，在动物体内的半衰期不过数小时，通常不太可能检出原药的残留，如呋喃唑酮在停药后12 h内从组织中消失，而代谢物以组织蛋白结合态的形式存在，在体内可残留数周，当原药浓度降至检测限以下时，检测动物组织中硝基呋喃原药不足以反映其真实的残留水平，因此，检测其代谢物浓度仍是可能的。呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因在动物体内的代谢物分别为3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-内酰脲（AHD），当吃了含有硝基呋喃代谢物残留的食品，代谢物在胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。2002年我国农业部第193号公告也将硝基呋喃抗菌剂列入《食品动物禁用的兽药和其他化合物清单》，但硝基呋喃药物疗效好，价格低廉，农户片面追求经济效应，目前非法使用屡有发生，如2006年国内影响较大的多宝鱼、桂花鱼中检出硝基呋喃事件［1］。由于这些标志物检测技术难度较大，因此分析硝基呋喃代谢物成为当前众多学者研究的焦点。

目前，国内外报道用于检测硝基呋喃类抗生素及其代谢物残留的方法主要有试剂条法、酶联免疫法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）、高效液相色谱-串联质谱法（HPLCMS/MS）。ELISA法由于采用了特异性抗体，具有灵敏度高、经济、操作简便、检测时间短等优点，但仍然不能实现在线检测，假阳性率较高。所以ELISA法一般用于药物残留的定性分析，只能对药物残留进行初步筛查，阳性样品需要进一步确证。HPLC法广泛用于多组分混合物的分离和分析，特别是有机化合物的定量分析。动物组织基质比较复杂，干扰较多，定性仍较困难，易出现假阳性。液相色谱与质谱联用，大大提高了分析的灵敏度、选择性、特异性和准确性。HPLC-MS/ MS法采用多反应监测模式（MRM）模式，结合液相保留时间及MRM特征离子对进行定性和定量，可以减少由于保留时间相同而待测离子不同所带来的干扰，同时提高了检测灵敏度，尤其适合于基质复杂样品的分析［2-17］。所以本文在国标GB/T 21311-2007和农业部781号公告-4-2006方法基础上，减少了洗涤去除脂肪的步骤，同时考察了pH和光照对测定的影响。在酸性条件下使硝基呋喃代谢物与蛋白质水解成游离态，2-硝基苯甲醛（2-NB）衍生，乙酸乙酯提取，UPLC-MS/ MS内标法测定鱼肉中硝基呋喃代谢物残留量。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

Ultimate 3000超高压液相色谱仪，TSQ Quantum ultra三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）：赛默飞世尔科技有限公司；高速离心机：SiGma公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪，超纯水机：艾科浦；恒温水浴锅：上海百典仪器设备仪器有限公司；梅特勒pH计：上海艾测电子科技有限公司。

硝基呋喃代谢物以及内标标准品［AOZ（AOZ-D4），AMOZ（AMOZ-D5）、AHD.HCl（AHD-13C3）、SEM.HCl （SCA-13C15N2），纯度≥99.0%］：Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸乙酯为色谱纯：购置于美国Fisher公司；邻硝基苯甲醛（纯度大于99%）：购置于北京裕策达科贸有限公司；磷酸氢二钾、氢氧化钠（均为分析纯）：均购置于天津科密欧化学试剂有限公司；优级纯盐酸：广州绿百草生物科技有限公司。

标准储备液：分别称取硝基呋喃代谢物标准品以及内标10mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，各组分浓度均为1.0 mg/mL。吸取适量的标准储备液分别配制成0.1 μg/mL的混合标准使用液和混合内标使用液。

衍生化试剂（0.1 mol/L）：称取0.15 g邻硝基苯甲醛溶于10 mL乙腈中，临用现配。

1.2样品的处理

鲜活鱼经剖杀去除掉头、骨、内脏，将肉切成块状，用电动绞肉机打成浆状，于-20℃避光保存待测。

将鱼样解冻，准确称取2.00 g样品于50 mL塑料离心管中，加入100 μL内标混合溶液、0.2 mol/L的盐酸溶液10 mL和0.3 mL衍生剂，旋涡混匀，置于37℃水浴避光衍生16h，衍生完成后，10000r/min离心5min，转移水解液于50 mL离心管中，加入2mL 0.5mol/L的K2HPO4溶液，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH在7.1～7.5之间，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋，静置分层，将乙酸乙酯层转入25 mL离心管中，再加入10 mL乙酸乙酯萃取，合并萃取溶液，氮气吹干，用1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水（体积比为10∶90）定容，过0.22 μm滤膜，供测定。

1.3色谱条件

色谱柱：HypersilGold-C18，150mm×2.1 mm×1.9 μm （Thermo）；柱温：30℃；进样体积：10 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脱条件见表1。

表1梯度洗脱条件Table 1　Gradient elution conditions

1.4质谱条件

离子源：ESI（+）；喷雾电压：3 000 V；毛细管温度：350℃；蒸发温度：0℃；鞘气压力：276 kPa；辅助气压力：4.5 L/min；碰撞气（Ar）压力：0.2 Pa。SRM优化参数见表2。

表2　4中硝基呋喃代谢物和相应内标物的质谱参数Table 2　MS parameters of four nitrofuran metabolites and corresponding internal standards

2　结果与讨论

2.1硝基呋喃代谢物的水解和衍生化反应

硝基呋喃类抗生素在体内迅速代谢，且代谢物以蛋白结合态形式存在于组织中，在适当酸性条件下水解成游离态，所以本文选择0.2 mol/L的盐酸水溶液为水解液。4种硝基呋喃代谢物的相对分子量较小，离子化效率低，特征碎片离子少，且位于低质量数范围，质谱背景干扰较大，检测灵敏度低，直接进行质谱测定较困难，故需进行衍生化反应。一般采用邻硝基苯甲醛作衍生剂［4-7］，但4种代谢物衍生化效率不同（衍生化效率为68%～75%）［8］，衍生条件对定量结果影响较大，所以应严格控制标准品和样品衍生条件的一致。衍生物见光极易分解，应避光衍生过夜，使质谱信号达到最大值。

2.2LC-MS-MS分析

通过ESI+模式对4种目标化合物及4种内标化合物进行全扫描，找出准分子离子峰（M+H），并且以此准分子离子峰为母离子改变碰撞电压进行轰击，进行二级质谱扫描，找出2个信号较强的碎片离子构成监测离子对（见表2）。AHD碎片离子的扫描见图1。

图1AHD准分子离子和碎片离子质谱图Fig.1　Quasi-molecular and fragment ions of CV

从图1上可以看出，AHD的M/Z为 103.9和133.9两个碎片离子的响应信号较强，以这两个碎片离子和准分子离子峰构成监测离子对。通过改变透镜电压，使母离子最大效率通过一级质谱进入二级质谱进行碰撞，对碎片离子的碰撞能量进行优化，提高碎片离子的响应强度。

AHD准分子离子透镜电压优化曲线和碎片离子碰撞能量优化曲线见图2。

在流动相中加入适量的甲酸、乙酸和低浓度的挥发性缓冲盐得到更加丰富的离子碎片信息，改善峰形，提高测定的灵敏度，本文在流动相水中加入0.1%甲酸，获得良好的效果，以MRM模式对待测物质进行定性定量分析。

混标溶液MRM图见图3。

图2　AHD准分子离子透电压优化曲线和碎片离子碰撞能量优化曲线Fig.2　Optimizing curves of AHD quasi-molecular ion tube lens and fragment ion collision energy

图3　混合标准溶液的提取离子色谱图Fig.3　Ion chromatogram of extract in mixed standard solution

2.3pH和光照的影响

在衍生化完成后进行萃取操作时，溶液的pH对萃取效率影响很大。试验发现，不同pH条件下，4种硝基呋喃代谢物的衍生物的萃取效率不同。pH在7.1～7.5之间萃取效率最高，4种代谢物衍生物的萃取效率均达到90%以上，而AHD和AMOZ受pH的影响最大，pH小于4时，AMOZ不能从水相转移到有机相中，而pH大于8时，AHD的萃取效率极低，所以，应调节pH成弱碱性（7.1～7.5）时，各组分的萃取效率最高［8］。水解液为0.2 mol/L盐酸水溶液，直接用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.1～7.5时，由于不同样品的酸度有差异，体系没有缓冲容量，调节pH在最佳萃取范围较困难。在水解液中加入2 mL 0.5 mol/L的K2HPO4溶液，具有一定缓冲容量，再用1 mol/L氢氧化钠溶液较易调节pH在7.1～7.5之间，保证萃取效率，减少定量误差。

将浓度相同的硝基呋喃代谢物衍生物分别放置在光照和避光条件下，考察光照的影响，发现4种代谢物的衍生物对光敏感，且敏感程度不一致。AHD对光线最不敏感，光照下放置6 h后含量基本不变，而AMOZ对光照最敏感，放置6 h后几乎完全分解，AOZ 和SEM相对稳定，但放置后也出现不同程度的分解，而避光放置的硝基呋喃代谢物衍生的溶液含量基本不变，因此在整个样品前处理应在避光的条件下进行，减少分解，提高测定灵敏度，避免假阴性的出现。

2.4标准工作曲线和检出限

分别吸取0.1 μg/mL的混合标准使用液50、100、200、400、800、1 000 μL于50 mL离心管中，分别加入混合同位素内标工作液100 μL，其余操作步骤同1.2样品的处理，氮吹定容至1.00 mL，即得5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0 ng/mL的浓度系列，其中混合同位素内标含量为10 ng/mL按优化的仪器条件进行测定。用峰面积与同位素内标峰面积比值为纵坐标，以质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，AHD：y=0.046 2x+ 0.020 2（r=0.999 9）；AMOZ：y=0.044 68x+0.049 0（r= 0.999 8）；AOZ：y=0.049 89x+0.013 7（r=0.999 6））；SEM：y=0.041 6x-0.003 9（r=0.999 3），结果表明4种代谢物在2.5 μg/kg～50 μg/kg的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数大于0.999 3。以各目标物在阴性样品中的3S/N计算该方法的检出限，4种代谢物的检出限为0.2 μg/kg。

2.5方法回收率及精密度试验

取2.00 g阴性样品于50 mL塑料离心管中，分别加入2.0、20.0、40.0 ng混合标准溶液和10 ng混合内标溶液，即阴性样品中4种硝基呋喃代谢物分别为1.0、10.0、20.0 μg/kg和内标物为5.0 μg/kg，低、中、高3个添加水平，涡旋混均，放置过夜吸收，按照上述样品处理方法水解、净化、上机测定，该方法回收率及精密度见表3。

表3　回收率及精密度试验结果（n=6）Table 3　Result of recoveries and precision

3　结论

本文通过水解、衍生、净化测定鱼肉中硝基呋喃代谢物的残留量，方法的回收率在83.0%～101%之间，相对标准偏差在4.2%～11.3%之间，检出限为0.2 μg/kg，满足鱼肉中硝基呋喃代谢物的测定要求。该方法受pH和光照影响较明显，所以在测定过程中应严格控制试验条件，同时加入同位素内标进行校正，提高定量结果的准确性。

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Determination Metabolite Residue of Nitrofuran in Fish by UPLC-MS/MS

ZHOU Yi-bing1，WU Kun2，LI Lei1，LIN Ye1，LIU Li-ya1，*
（1.Guizhou Center for Diseases Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2.Guizhou Normal College，Guiyang 550018，Guizhou，China）

AHD，AMOZ，AOZ，SEM residues in fish were detected by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The samples were hydrolyzed by hydrochloric acid，was derivated by 2-NB at 37℃after 16 h and then added with 2 mL 0.5 mol/L dipotassium hydrogen phosphate，adjusted pH to 7.1-7.5 with sodium hydroxide，extracted by ethyl acetate，nitrogen evaporated，the mobile phase volumed.Electrospray ionization source was applied and operated in positive ion mode，using MRM scanning and internal standard method for quantitative analysis.Four metabolites showed a good linear correlation between 2.5 μg/kg to 50 μg/kg concentration with range coefficient greater than 0.999 3 and the lowest detection limit 0.2 μg/kg.The average recovery（n=6）of the samples at three levels（1，10，20 μg/kg）ranged from 83.0%to 101%with the relative standard deviation between 4.2%and 11.3%.The method used isotope internal standard for determination which corrected influence of incomplete derivation，decomposition by the light and solution pH on the extraction efficiency and improved the accuracy of quantitative results.The method was applicable to screening and confirmation of four nitrofuran metabolites in fish.

nitrofuran metabolites；fish；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.041

周贻兵（1985—），男（汉），副主任技师，硕士，研究方向：食品分析。
*

刘利亚，男，副主任技师，学士，主要从事于食品分析、保健品和化妆品检验检测。

2015-04-01