双酶水解蚕蛹蛋白工艺研究

李健，蒋艳忠（广西工业职业技术学院，广西南宁530001）

双酶水解蚕蛹蛋白工艺研究

李健，蒋艳忠*
（广西工业职业技术学院，广西南宁530001）

研究了碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶法水解蚕蛹蛋白的工艺条件。通过单因素试验探讨了温度、加酶量、底物浓度、水解时间、酶质量比（碱性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）对蚕蛹蛋白水解效果的影响，然后通过正交试验优化水解工艺务件。结果表明，影响水解率的主次关系依次为：温度、底物浓度、时间、酶用量、酶比。优化的工艺条件为：温度55℃，加酶量3.0%，底物浓度3%，水解时间6h，酶质量比4∶1，上述条件下蚕蛹蛋白水解率达25.04%。

碱性蛋白酶；木瓜蛋白酶；蚕蛹蛋白；水解度

蚕蛹是蚕茧抽丝后剩下的主要副产物，我国每年副产约50多万t干蚕蛹［1］。干蚕蛹含有60.0%左右的蛋白质，且8种人体必需氨基酸占总氨基酸的42%左右，符合FAO/WHO建议的理想氨基酸模式，是一种优质的蛋白资源［1-2］。目前，蚕蛹主要被用作动物饲料，仅有少量被人类食用［1，3］，因此，造成了蚕蛹资源的极大浪费。将蚕蛹蛋白进一步水解成多肽和氨基酸后，将更容易为人体所吸收，在食品、保健品行业具有广阔的应用前景，国内已有厂家将蚕蛹水解制成复合氨基酸产品［4］。

蚕蛹蛋白主要为球蛋白，水解时可以采用酸水解、碱水解和酶水解的方式。但是酸水解导致色氨酸全部破坏，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸部分破坏；碱水解引起消旋作用而降低营养价值；酶水解时反应条件温和，营养价值得以保障［5-6］。本试验以脱脂蚕蛹粉为原料采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解工艺，对温度、时间、底物浓度、加酶量、酶比等因素进行了单因素和正交试验，探讨了双酶水解蚕蛹蛋白的优化条件。

1　试验部分

1.1试剂与仪器

干蚕蛹：购于广西宜州缫丝厂；JY10001上皿电子天平：上海精密科学仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；HH-S型水浴锅、SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；JB50-D型增力电动搅拌机：上海标本模型厂；LABOROTA 400旋转蒸发器：德国heidoph公司；pH 211酸度计、101A-E1电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；TGL-16C高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；KDY-9830凯氏定氮仪：北京思备得研究所；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶：由南宁东恒华道生物科技有限责任公司提供；石油醚、甲醛、NaOH、HCl、H2SO4、H3BO3、K2SO4、Cu2SO4等均为分析纯。

1.2脱脂蚕蛹的酶水解处理［7］

称取一定量的干蚕蛹，用粉碎机粉碎，于250 mL三口烧瓶中，按一定比例加入石油醚，在沸点温度下恒温水浴设定时间，并不定时搅拌使物料溶剂充分接触。冷却至室温，真空抽滤，滤饼即为脱脂蚕蛹粉。

准确称取一定量的脱脂蚕蛹粉按设定的底物浓度加入一定量的水。采用1 moL/L NaOH溶液调节至所需pH，加热至85℃保持20 min后冷却至40℃以下，然后加入蛋白酶，在保持一定pH及温度条件下水解。水解结束后煮沸10 min灭酶，冷却后离心分离，取上清液。沉淀用适量蒸馏水洗涤1次，合并上清液，并记录体积。采用甲醛滴定法测定上层清液中氨基酸态氮含量。

1.3各项指标检测

1.3.1脱脂蚕蛹粉蛋白质质量分数的测定

脱脂蚕蛹粉蛋白质质量分数的测定采用凯氏定氮法测定（蛋白质换算系数为6.25）。

1.3.2水解液中氨基酸态氮含量的测定

水解液中氨基酸态氮含量的测定采用甲醛滴定法测定［8］。

1.3.3水解度（DH）的计算

式中：N为水解液中氨基酸态氮含量，g/mL；V为水解液体积，mL；G为脱脂蚕蛹粉质量，g；P为脱脂蚕蛹粉蛋白质质量分数，%；6.25为蛋白质换算系数。

2　结果与讨论

通过参考文献［6］及对碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解蚕蛹蛋白的试验结果表明，碱性蛋白酶的水解效果明显优于木瓜蛋白酶，但蛋白酶具有底物特异性，对于同一种蛋白，不同蛋白酶的酶切位点不同，多酶协调作用更有利于将蛋白质水解成低分子肽类［9］。因此本试验采用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶双酶水解蚕蛹蛋白。

2.1双酶水解蚕蛹蛋白的单因素试验［6-7，10］

2.1.1温度对蚕蛹蛋白水解度的影响

在酶用量2%，底物浓度4%，时间4 h，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比3∶1的条件下，先调pH 9加碱性酶水解2 h后，再调pH 8加木瓜蛋白酶水解2 h，考察温度对蚕蛹蛋白水解度的影响。温度对蚕蛹蛋白水解度的影响见图1。

图1温度对蚕蛹蛋白DH的影响Fig.1　Effect of temperature on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

温度升高，蚕蛹蛋白水解度不断提高，55℃达到最大，这是因为酶对温度有适应范围，在最适应温度下酶的活性最高，高于或低于最适温度时酶的活性下降。因此后续试验过程拟选用温度为55℃。

2.1.2加酶量对蚕蛹蛋白水解度的影响

在温度55℃，其它条件及试验过程同2.1.1，考察加酶量对蚕蛹蛋白水解度的影响。加酶量对蚕蛹蛋白水解度的影响见图2。

图2 加酶量对蚕蛹蛋白DH的影响Fig.2　Effect of amount of enzyme on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

结果表明，随着加酶量的增加DH逐渐增加，增大加酶量会导致成本加大。故在后续试验过程选用加酶量2.0%。

2.1.3底物浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响

在温度55℃，加酶量2%，时间4 h，酶质量比3∶1的条件下，考察了底物浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响。底物浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响见图3。

图3底物浓度对蚕蛹蛋白DH的影响Fig.3　Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

结果表明，随着脱脂蚕蛹粉浓度的增加蚕蛹蛋白DH逐渐降低。这是由于脱脂蚕蛹粉浓度小，酶与蛋白质能够充分反应，但过低的脱脂蚕蛹粉浓度会导致后续处理的难度加大。因此后续试验过程拟选用底物浓度4%。

2.1.4时间对蚕蛹蛋白水解度的影响

在温度55℃，加酶量2%，底物浓度4%，酶质量比3∶1的条件下，考察了时间对蚕蛹蛋白水解度的影响。时间对蚕蛹蛋白水解度的影响见图4。

图4 时间对蚕蛹蛋白DH的影响Fig.4　Effect of time on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

结果表明，随着时间的延长，蚕蛹蛋白的水解度逐渐增加。5 h以后DH变化逐渐平缓。因此后续试验过程拟选用5 h。

2.1.5碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比对蚕蛹蛋白水解度的影响

在温度55℃，加酶量2%，底物浓度4%，时间5 h的条件下，考察了酶比对蚕蛹蛋白水解度的影响。酶比对蚕蛹蛋白水解度的影响见图5。

结果表明，随着碱性蛋白酶用量的增加，蚕蛹蛋白DH增加，当达到4∶1以后已增加不明显，说明碱性蛋白酶的水解效果优于木瓜蛋白酶。

图5 酶质量比对蚕蛹蛋白DH的影响Fig.5　Effect of enzyme mass ratio on the degree of hydrolysis of silkworm pupa protein

2.2正交试验优化双酶水解蚕蛹蛋白的条件

在单因素试验的基础上，选取温度、加酶量、底物浓度、时间和酶比（碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比）5个因素，以蚕蛹蛋白水解度（DH）为评价指标，进行L16（45）正交试验。正交试验因素及水平见表1，正交试验结果及分析见表2。

表1　正交试验因素及水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验结果及分析Table 2　Rresults of orthogonal test and analysis

续表2　正交试验结果及分析Continue table 2　Rresults of orthogonal test and analysis

极差分析表明，在所考察因素的水平范围内，影响蚕蛹蛋白水解的主次顺序依次为温度、底物浓度、时间、酶用量、酶质量比；优化的工艺方案为A3B1C4D4E2，即温度55℃，底物浓度3%，水解时间6 h，加酶量3.0%，酶质量比4∶1，用优化的工艺方案再次进行试验，结果得蚕蛹蛋白水解率为25.04%，高于正交试验中的最高值24.73%，说明优化结果可靠。

3　结论

1）在试验条件下通过单因素和正交试验得知双酶水解蚕蛹蛋白的优化条件为：温度55℃，底物浓度3%，水解时间6 h，加酶量3.0%，酶质量比（碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶）4∶1，碱性蛋白酶处理时pH 9.0、木瓜蛋白酶处理时pH 8.0，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的水解时间按1∶1分配，上述条件下蚕蛹蛋白水解率为25.04%。

2）通过正交试验数据分析得知，对蚕蛹蛋白水解率影响的主次关系依次为：温度、底物浓度、时间、酶用量、酶比。

［1］Zhou J，Han D X．Proximate，amino acid and mineral composition of pupae of the silkworm Antheraea pernyi in China［J］．Journal of Food Composition and Analysis，2006，19（8）：850-853

［2］Yang Yunan，Tang Liman，Tong Ling，et al．Silkworms euhure as asource of protein for humans in spaee［J］．Advances in Space Research，2009，43（8）：1236-1242

［3］Rangaeharyulu P V，Giri S S，Paul B N，et al．Utilization of fermented silkworm pupae silage in feed forcarps［J］Bioresource Technology，2003，86（1）：29-32

［4］罗贵伦，陈器．蚕蛹硫酸水解制备复合氨基酸的研究［J］．食品工业科技，2003，24（5）：59

［5］佳善．蚕蛹蛋白的开发利用［J］．食品科技，1996（1）：16-17

［6］朱新鹏．碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白质工艺的研究［J］．保鲜与加工，2011，11（4）：19-22

［7］朱新鹏，张恒瑞．蚕蛹蛋白双酶法水解工艺优化［J］．湖北农业科学，2012，51（10）：2081-2084

［8］黄伟坤．食品检验与分析［M］．北京：轻工业出版社，1989：57-58

［9］方佳茂，刘倔琪，庄楚周，等．复合酶水解蚕蛹蛋白制备功能性寡肽的工艺研究［J］．现代食品科技，2012，28（3）：323-328

［10］林高堂，蒋立文，李丽蓉．双酶水解蚕蛹蛋白工艺条件研究［J］．广东蚕业，2012，42（4）：33-37

Study on Technology for Hydrolysis of Silkworm Pupa Protein with Double Enzyme

LI Jian，JIANG Yan-zhong*
（Guangxi Vocational＆Technical Institute of Industry，Nanning 530001，Guangxi，China）

The technology for silkworm pupa protein hydrolysis by double enzymatic（alkaline protease and papain）was studied．Single factor and orthogonal experiments were used to study the effects of the parameters such as temperature，amount of enzyme，substrate concentration，time，mass ratio of a1kaline protease and papain on the hydrolysis degree of silkworm pupa protein.The results showed that the temperature was the more important factor that affected the effect of hydrolysis，following substrate concentration and time and amount of enzyme and enzyme mass ratio，the optimal conditions were obtained with orthogonal experiments，as follows：the temperature was 55℃，the amount of enzyme was 3.0%，the substrate concentration was 3%，the time was 6 h and the enzyme mass ratio was 4∶1.The hydrolysis degree of silkworm pupa protein under these conditions could be 25.04%．

alkaline protease；papain；silkworm pupa protein；degree of hydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.024

2011年度广西教育厅科研立项项目（201106LX776）

李健（1970—），男（壮），工程师，本科，从事天然物提取、化工工艺的教学和科研。
*

蒋艳忠（1971—），女（汉），副教授，硕士，从事天然物提取、应用化工的教学和科研。

2015-04-29