响应面法优化果胶酶澄清酸枣汁工艺的研究

贾东升，李荣乔，谢晓亮，温春秀，崔施展，刘铭，刘灵娣（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

响应面法优化果胶酶澄清酸枣汁工艺的研究

贾东升，李荣乔，谢晓亮*，温春秀，崔施展，刘铭，刘灵娣
（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

优化果胶酶澄清酸枣汁的工艺。试验以酸枣汁中果胶含量为响应值，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，选取酶解pH、酶解温度、果胶酶用量以及酶解时间进行四因素三水平响应面试验，优化果胶酶澄清酸枣汁工艺。试验建立了回归方程，即果胶含量Y=166.58-1.23A+0.11B+0.17C-0.63D+8.57AB-4.1AC-2.18AD+0.93BC-0.57BD+0.92CD+ 14.65A2+39.16B2+40.00C2+42.06D2。通过响应面分析得到了果胶酶的最佳酶解条件：酶解pH 4.5、酶解温度55℃、果胶酶用量0.31%、酶解时间1.5h，在此条件下，酸枣汁中果胶含量降至170.273mg/L，降解率为65.54%，与模型预测值之间具有较好的拟合性。果胶酶澄清酸枣汁效果明显，本研究所得为酸枣汁澄清工艺提供了良好的技术参数。

酸枣汁；果胶；果胶酶；响应面；澄清

酸枣是我国北方山区较为普遍的一种野生果树资源，含有丰富的维生素、蛋白质、脂肪、多糖、多酚以及钙、铁等矿质元素［1-3］，具有生津止渴、开胃健脾、养精益气等功能，据中医典籍《神农本草经》记载，酸枣可以“安五脏，轻身延年”［4-5］。用酸枣制作的酸枣汁口感酸甜，营养丰富，在生产过程中，由于处理不当，酸枣汁容易出现后浑浊和沉淀现象，影响了产品的外观品质并降低了其市场价值。多项研究表明，果汁中的果胶可与蛋白质发生亲和作用，形成沉淀。另外，果胶类物质的存在会使混浊粒子保持稳定的胶体体系而不易沉降，长期放置后浑浊粒子会逐渐沉淀，影响产品的感官品质［6］。因此在果汁加工中，应该考虑果汁中果胶对产品的影响，尽量将其去除。目前果汁中果胶的去除主要包括过滤以及果胶酶酶解两种方法［7］，由于超滤过程中果胶容易堵塞滤膜而影响过滤效率，因此果汁超滤之前会先采用果胶酶脱胶［8-10］以提高过滤效率。本研究采用果胶酶处理酸枣汁并采用响应面试验［11-12］优化果胶酶酶解工艺，以期避免酸枣汁后浑浊和沉淀现象的发生。

1　材料和方法

1.1仪器、材料与试剂

1.1.1仪器

752PC紫外/可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HHW-21CU-600水浴锅：上海福玛试验设备有限公司；3K18离心机：Sigma。

1.1.2材料

酸枣：河北邢台。

1.1.3试剂

果胶酶：和氏璧生物技术有限公司，食品级；半乳糖醛酸：上海源叶生物科技有限公司，分析纯；咔唑：上海瑞永生物科技有限公司，分析纯；无水乙醇：天津市光复科技发展有限公司，分析纯；氢氧化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯；浓硫酸：北京市化学试剂公司，分析纯；α-萘酚：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

1.2方法

1.2.1酸枣汁制备

称取酸枣40 g，清洗，将其破碎，破碎程度以表皮破裂而保持酸枣果体完整为度，然后在料液比为1∶20（g/mL）、浸提温度为90℃的条件下保温浸提2 h。双层滤纸抽滤，冷却。

1.2.2酸枣汁中果胶含量测定

酸枣汁中果胶含量测定采用咔唑比色法［13-14］。

1.2.2.1果胶质的沉淀

取15 mL酸枣汁于50 mL刻度离心管中，加入95%热（75℃）乙醇溶液25 mL，在85℃水浴中加热10 min，充分搅拌，再加入95%乙醇定容至50 mL，5 000 r/min离心15 min，弃去上清，用85℃的63%乙醇洗涤沉淀，离心并弃去上清，此步骤重复操作，直至清液中不再产生糖反应。

1.2.2.2果胶总量提取液的制备

将制备的果胶沉淀全部洗入100 mL容量瓶中，加入5 mL 1 mol/L氢氧化钠并用水定容至刻度，混匀，放置15 min并不时摇荡，过滤后滤液用于比色测定。

1.2.2.3比色测定

取大试管，加入1 mL果胶提取液，再加入0.5 mL 0.1%咔唑乙醇溶液，不断摇动试管，再加入6 mL浓硫酸，立刻将试管放入85℃水浴中5 min，再使之冷却15 min，然后立即用分光光度计在525 nm波长处用试剂空白调零，测定吸光值。

1.2.2.4标准曲线的绘制

准确称取半乳糖醛酸100 mg于100 mL容量瓶中，加入0.5 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，并用水定容至刻度，取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL分别注入100 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得1组浓度为10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的半乳糖醛酸标准溶液，分别按1.2.2.3方法步骤测量，以吸光值为纵坐标、半乳糖醛酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.5果胶含量与降解率计算

果胶的含量以mg/L为单位表示，分别按式（1）和式（2）计算果胶含量与降解率。

1.2.3果胶酶单因素酶解工艺

影响果胶酶澄清效果的因素主要有酶解pH、酶解温度、果胶酶用量（以酸枣干重计）以及酶解时间，本研究选取这4个因素进行单因素试验，其中pH水平分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5；酶解温度分别为40、45、50、55、60、65、70℃；果胶酶用量分别为0.10%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%；酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，以酸枣汁中剩余果胶含量为指标，筛选出各因素的较优水平进行响应面试验设计。

1.2.4响应面试验优化果胶酶酶解工艺

根据单因素试验结果确定试验因素及水平，以酸枣汁中剩余果胶含量为响应值，根据Box-Benhnken中心组合设计原理设计试验优化果胶酶酶解工艺，试验因素及水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1　Factors and levels for Box-Behnken experiment

2　结果与分析

2.1果胶含量测定标准曲线

果胶含量测定标准曲线为Y=0.009x-0.051。其中Y为吸光值，x为半乳糖醛酸浓度（μg/mL）。

2.2果胶酶单因素酶解试验

2.2.1pH对果胶酶酶解效果的影响

pH对果胶酶酶解效果的影响见图1。

图1　pH对果胶酶酶解效果的影响Fig.1　The effect of pH on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

由图1可以看出，酸枣汁中果胶含量随果胶酶酶解pH的变化先降低后升高。pH从2.5升至4.5时，果胶水解率逐渐增强，酸枣汁中果胶含量逐渐降低；pH 从4.5升至9.5时，果胶水解率逐渐降低，酸枣汁中果胶含量逐渐升高；因此确定果胶酶的最适酶解pH为4.5。2.2.2酶解温度对果胶酶酶解效果的影响

酶解温度对果胶酶酶解效果的影响见图2。

图2　酶解温度对果胶酶酶解效果的影响Fig.2　The effect of temperature on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

由图2可知酸枣汁中果胶含量随果胶酶酶解温度的变化先降低后升高。温度从40℃升至55℃时，果胶水解率逐渐升高，酸枣汁中果胶含量逐渐降低；温度继续从55℃升至70℃时果胶水解率逐渐降低，酸枣汁中果胶含量逐渐升高，水解率逐渐降低，因此确定果胶酶的最适作用温度为55℃。

2.2.3果胶酶用量对果胶酶酶解效果的影响

果胶酶用量对果胶酶酶解效果的影响见图3。

由图3可知，酸枣汁中果胶含量随果胶酶添加量的增加逐渐降低，当添加量达到0.3%时变化不再明显，下降趋势放缓，因此确定果胶酶添加量为0.3%。

2.2.4酶解时间对果胶酶酶解效果的影响

酶解时间对果胶酶酶解效果的影响见图4。

图3　果胶酶用量对果胶酶酶解效果的影响Fig.3　The effect of enzyme amount on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

图4　酶解时间对果胶酶酶解效果的影响Fig.4　The effect of enzymolysis time on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

由图4可知，酸枣汁中果胶含量随果胶酶作用时间的延长而逐渐降低，酶解1.5 h后含量变化趋势趋于平缓，因此确定酶解时间为1.5 h。

2.3响应面试验模型方差分析

在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，以酸枣汁中果胶含量为响应值，选择酶解pH、酶解温度、果胶酶用量以及酶解时间作为自变量进行响应面优化试验，共设计29个试验点，设计方案及试验结果见表2。

表2　响应面试验设计及结果Table 2　Experiment design and results of response surface methodology

续表2　响应面试验设计及结果Continue table 2　Experiment design and results of response surface methodology

根据表2的试验结果，得到回归方程：果胶含量Y=166.58-1.23A+0.11B+0.17C-0.63D+8.57AB-4.1AC-2.18AD+0.93BC-0.57BD+0.92CD+14.65A2+39.16B2+ 40.00C2+42.06D2。

回归模型方差分析及显著性检验见表3，回归方程可信度分析见表4。

表3　回归模型方差分析及显著性检验Table 3　Results of regression analysis

表4　回归方程可信度分析Table 4　The credibility analysis of the regression equation

由表3和表4可知，本研究模型项P值＜0.001，极显著，模型失拟项P值为0.069 8，不显著，说明模型可用；复相关系数R2为0.999 5，矫正相关系数为0.999 0，预测相关系数为0.997 4，说明仅有0.001%的变异不能由该模型解释，模型拟合度较好；信噪比为128.270 4，大于4，说明该模型可用于优化果胶酶的酶解工艺；变异系数为0.41%，较小，说明本研究试验稳定性好，试验数据可信。

由表3可知，果胶酶用量、果胶酶用量与酶解时间的交互作用、果胶酶用量与酶解pH的交互作用、果胶酶用量与酶解时间的交互作用以及4个因素的二次项对果胶酶酶解效果影响极显著；果胶酶酶解温度对果胶酶酶解效果影响显著；酶解时间、pH、酶解时间与pH的交互作用、酶解时间与酶解温度的交互作用以及pH与酶解温度的交互作用对果胶酶酶解效果无显著影响。

各因素交互作用对果胶酶酶解效果的影响见图5。

由图5可知，4个因素水平选值合理，回归模型存在最大值，最佳落点在试验考察的区域内。由该模型预测得到的最佳酶解工艺为：酶解pH 4.5、酶解温度55.04℃、果胶酶用量0.31%、酶解时间1.5 h，在此工艺条件下，酸枣汁经酶解后果胶含量为166.552 mg/L。2.4果胶酶酶解工艺验证试验

为了验证模型的可靠性，采用修正的酶解条件：酶解pH 4.5、酶解温度55℃、果胶酶用量0.31%、酶解时间1.5 h，平行试验3次。3次试验所得果胶含量平均值为170.273 mg/L，与理论预测值非常接近，相对误差为2.19%，较小，证明该回归模型可靠，该模型可用于果胶酶酶解工艺的优化试验。

图5　各因素的交互作用对果胶酶酶解效果的影响Fig.5　Response surfaces showing the interactive effects of factors on the hydrolysis effect of pectinase enzyme

3　结论

果胶酶澄清酸枣汁工艺中，酶解pH、酶解温度、果胶酶用量以及酶解时间均对酶解效果有影响。通过单因素以及响应面优化试验，得到了果胶酶的最佳酶解工艺条件：酶解pH 4.5、酶解温度55℃、果胶酶用量0.31%、酶解时间1.5 h，在此条件下，酸枣汁中果胶含量降至170.273 mg/L，降解率为65.54%，效果明显，本研究为酸枣汁澄清工艺提供了良好的技术参数。

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Optimization of Process Conditions of Wild Jujube Juice Clarification by Pectinase Using Response Surface Methodology

JIA Dong-sheng，LI Rong-qiao，XIE Xiao-liang*，WEN Chun-xiu，CUI Shi-zhan，LIU Ming，LIU Ling-di
（Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Medicinal Herbs Research Center，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

The study focused on the optimization of process conditions of wild jujube juice clarification by pectinase.The contents of pectin was used as response value，pH，temperature，enzyme amount，enzymolysis time were choosed as variables.According to the principle of Box-Behnken experimental design，the three variables at four selected levels were optimized by response surface methodology.A mathematical regression model was established，Y=166.58-1.23A+0.11B+0.17C-0.63D+8.57AB-4.1AC-2.18AD+0.93BC-0.57BD+0.92CD+ 14.65A2+39.16B2+40.00C2+42.06D2.Results showed that the optimum process conditions were found to be enzymolysied at 55℃with a total enzyme dosage of 0.31%and 1.5 h under the hydrolysis pH 4.5.under this condition，contents of pectin decreased to 170.273 mg/L，which was well matched with the predicted value，the degradation rates of pectin were 65.54%.Pectinase had an obvious effect on the clarification of wild jujube juice，this study provided good process parameters for the clarification of wild jujube juice.

wild jujube juice；pectin；pectinase；responsesurface methodology；clarification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.023

河北太行山区特色功能保健食品的开发研究（11231005D）作者简介：贾东升（1982—），男（汉），硕士研究生，主要从事中药功能食品研究。
*

谢晓亮（1962—），男，研究员，博士，主要从事中药资源、中药加工研究。

2015-04-05