纤维素酶辅助青稞粉提取淀粉工艺研究

赵彦巧，朱志勇，王凯，李建颖（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

纤维素酶辅助青稞粉提取淀粉工艺研究

赵彦巧，朱志勇，王凯，李建颖*
（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

采用纤维素酶辅助从青稞粉中提取淀粉，以淀粉提取率为评价指标，在单因素试验的基础上选择加酶量、酶解时间、酶解温度、pH4个主要影响因素进行正交试验，确定最佳的提取工艺条件，并将其应用于超声中试放大试验。正交试验结果表明，加酶量、酶解温度以及酶解时间与酶解温度的交互作用对淀粉提取率有显著影响。试验范围内获得的最佳提取工艺条件为：加酶量100U/g、酶解温度45℃、酶解时间6h、pH4.8，此时，淀粉提取率为80.02%。中试放大试验结果表明，正交试验所确定的最佳提取工艺稳定。

青稞；淀粉；提取；纤维素酶

青稞，是生长在我国西北、西南特别是西藏、青海一带的一种在地区农业生产中占据着极其重要地位的粮食作物，青稞的淀粉平均含量为59.25%，蛋白质平均含量为11.31%，β-葡聚糖平均含量为5%，远高于其他谷类作物，粗脂肪平均含量为2.13%，此外还含有丰富的水分、纤维和钼、铬、硒、锌等12种人体所需的微量元素［1］。

青稞淀粉具有良好的工业应用价值，而寻找一条简便高效的青稞淀粉提取工艺路线已成为当前促进青稞淀粉利用急需解决的重要问题之一。本试验采用纤维素酶辅助从青稞粉中提取淀粉，通过单因素试验确定料液比、加酶量、酶解时间、酶解温度、pH等因素对淀粉提取率的影响程度，并用正交试验设计优化纤维素酶辅助从青稞粉中提取淀粉的最佳工艺条件，提高淀粉提取率，并在此基础上进行超声中试放大试验，为建立理想的青稞淀粉提取工艺路线及青稞淀粉的利用奠定一定的基础。

1　材料与方法

1.1材料与设备

青稞：产于云南香格里拉县；纤维素酶，酶活力（U/ g）≥10 000；α-淀粉酶，酶活力（U/g）≥3 700；羧甲基纤维素钠、乙醚、碘、碘化钾、浓盐酸、乙醇（95%）、氢氧化钠、次甲基蓝、硫酸铜、乙酸锌、亚铁氰化钾、酒石酸钾钠、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、苯酚、无水硫酸钠、冰醋酸、醋酸钠等，均为国产分析纯。

AUY-220电子分析天平：日本SHIMADZU（岛津）公司；WE-3水浴恒温振荡器、EMS-2型加热定时磁力搅拌器、XMTD-204型数显式电热恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；DGG-H-3型电热鼓风干燥箱：天津市天宇实验仪器有限公司；SK5210LHC超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；PHS-3B型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；UV-7504型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；DL-6000型低速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；3-18K低温高速离心机：德国Sigma公司；TGCXZ-B5组合式超声循环提取机：北京弘祥隆生物技术股份有限公司。

1.2方法

1.2.1酶解辅助淀粉提取工艺

酶解辅助淀粉提取工艺流程参考Puchongkavarin H［2-3］、张玉玉［4］等的淀粉提取工艺并加以改进，提取工艺如下：青稞粉过100目筛、称重，按一定料液比加水浸泡制浆，加入纤维素酶、恒温振荡水浴酶解一定时间；将酶解液在5 000 r/min进行第一次离心，离心10 min，倒出上清液，刮去上层（暗黄色层），取下层（白色层）；将第一次离心得到的下层（白色层）加水制浆，过200目筛后，淀粉浆在5 000 r/min进行第二次离心，离心10 min，倒出上清液，小心刮去上层（灰色层），收集下层产品；自然条件干燥24 h，得青稞淀粉。

1.2.2淀粉提取率的计算

1.2.3淀粉含量的测定

依据GB/T 5009.9-2008《食品中淀粉的测定》淀粉酶水解法并加以改进测定淀粉含量。

1.2.4纤维素酶比活力的测定

采用普遍使用且结果较为准确的CMC-DNS法［5-6］测定纤维素酶的比活力。

1.2.5超声辅助中试放大试验

中试放大试验将小试剂量放大50倍，称取1000g过100目筛青稞粉原料，按料液比1∶4（g/mL）加入蒸馏水，采用TGCXZ-B5组合式超声循环提取机，超声条件为：超声时间10 min，频率30 kHz，间歇比30 s/5 s。超声后加入纤维素酶，控制各工艺条件与正交优化确定的最佳条件一致。

2　结果与讨论

2.1青稞原料中淀粉含量

经测定，本试验所选用的青稞原料的平均淀粉含量为56.77%，与文献［1］报道的淀粉平均含量59.25%相当，可以作为试验原料进行酶解辅助青稞粉提取淀粉的工艺研究。

2.2料液比对青稞淀粉提取的影响

在纤维素酶加入量80 U/g、提取温度50℃、提取时间8h的条件下，分别按料液比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL）进行青稞淀粉的提取，探讨料液比对其淀粉提取率的影响，结果见图1。

图1　料液比对淀粉提取率的影响Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on starch extraction yield

可以看出，淀粉提取率随着料液比的增大而逐渐提高。在料液比为1∶3（g/mL）时，由于浆液黏度较大，分子扩散速率较低，体系分散不均匀，不利于酶促反应的进行，因此，淀粉提取率较低。当料液比≥1∶5（g/mL）时，提取率达到最大。若再继续增加料液比，对淀粉提取率无明显影响。因此，料液比以1∶5（g/mL）为宜。

2.3加酶量对青稞淀粉提取的影响

在料液比1∶5（g/mL）、提取温度50℃、提取时间8 h的条件下，分别按加酶量为50、60、70、80、90、100U/g进行青稞淀粉的提取，探讨加酶量对其淀粉提取率的影响，结果见图2。

可以看出，随加酶量的增加，淀粉提取率呈先增大后减小的趋势，淀粉提取率最大值出现在加酶量为90 U/g时。当加酶量较少时，由酶促反应动力学可知，加酶量成为酶促反应的主要限制因素，此时酶浓度与反应速度呈正比关系［7］。当加酶量为90 U/g时，酶浓度达到饱和，故提取率达到最大值。当加酶量超过90 U/g时，淀粉提取率出现下降趋势。纤维素酶是一种复合酶，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等3种酶，作用机制较为复杂［8-9］。此时，浆液中的其它成分可能与纤维素酶作用，影响纤维素酶对植物细胞壁的降解。此外，纤维素酶系中一般还含有一定量的淀粉酶作为辅酶［10］，故当加酶量过大时，其含有的淀粉酶可能降解淀粉，使提取率降低。考察加酶量与其他因素的交互作用，故选取80、90、100 U/g进行正交试验。

2.4酶解时间对青稞淀粉提取的影响

在料液比1∶5（g/mL）、纤维素酶加入量80 U/g、提取温度50℃的条件下，分别提取2、4、6、8、10、12、24 h，探讨提取时间对其淀粉提取率的影响，结果见图3。

图2 加酶量对淀粉提取率的影响Fig.2　Effect of added-amount of cellulase on starch extraction yield

图3　酶解时间对淀粉提取率的影响Fig.3　Effect of enzymatic time on starch extraction yield

可以看出，随酶解时间的增加，淀粉提取率呈先增大后减小的趋势，最大值出现在酶解时间为6 h。在酶促反应初期，酶活性及反应速率均较高，随酶解时间的增加，淀粉提取率不断增加。但当酶解时间超过6 h后，酶促反应基本进行完全，酶解时间过长，可能会造成离心时过多的B淀粉与戊聚糖类物质粘连，从而导致提取率下降［11］。考虑酶解时间与其他因素可能存在交互作用，故选取4、6、8 h进行正交试验。

2.5酶解温度对青稞淀粉提取的影响

在料液比1∶5（g/mL）、纤维素酶加入量80 U/g、提取时间8 h的条件下，控制提取温度分别为35、40、45、50、55、60℃，探讨提取温度对其淀粉提取率的影响。结果见图4。

图4　酶解温度淀粉对提取率的影响Fig.4　Effect of enzymatic temperature on starch extraction yield

可以看出，酶解温度对淀粉提取率的影响较为显著，随酶解温度的增加，淀粉提取率呈现先增大后减小的趋势，最大值出现在酶解温度为45℃时。温度对酶促反应的影响一般呈现钟罩形曲线［12］，主要是由于温度较低时，升温有利于加快反应速率，而当温度过高时，蛋白质变性而使酶失活；此外，较高的温度也可能使提取出的淀粉糊化而影响淀粉提取效果，因此提取率在酶解温度超过45℃后开始下降。故选取40、45、50℃进行正交试验。

2.6pH对青稞淀粉提取的影响

在料液比1∶5（g/mL）、纤维素酶加入量80 U/g、提取温度50℃、提取时间8 h的条件下，分别调节浸提液的pH为3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6，探讨pH对其淀粉提取率的影响，结果见图5。

图5pH对提取率的影响Fig.5　Effect of pH on starch extraction yield

可以看出，在试验范围内，随pH的增加，淀粉提取率先增大后减小，提取率最大值出现在pH为4.4时。pH对酶促反应的影响一般也呈钟罩形曲线，存在酶的最适pH［10］。pH是酶促反应的主要影响因素之一，故选取pH为4.0、4.4、4.8 3个水平进行正交试验。

2.7正交试验优选提取工艺

在单因素试验的基础上，根据加酶量、酶解时间、酶解温度、pH 4个因素对淀粉提取率的影响，并考虑酶解时间和酶解温度、酶解时间和加酶量以及酶解温度和加酶量三组交互作用，采用正交试验优化，以淀粉提取率为评价指标，以确定提取青稞淀粉的最佳工艺条件，因素水平表见表1。选用L27（313）表，正交试验结果及极差分析表见表2。

表2 正交试验结果及极差分析表Table 2　The result and range analysis of orthogonal test

表1　正交试验的因素水平表Table 1　Factor-levels of orthogonal test

由表2可以看出，各因素对淀粉提取率的影响次序是：C（加酶量）＞B（酶解温度）＞A×B＞A×C＞A（酶解时间）＞B×C＞D（pH）。影响淀粉提取率的主要因素是C、B 和A×B，其他因素和交互作用的影响均较小。因素水平的选取，C应取C3，B应取B2。因素A和B的交互作用很大，甚至超过了因素A的单独作用，因此必须考虑因素A和B水平的最优搭配。根据表2，列出二元分析表如表3所示。

表3　A、B交互作用二元分析表Table 3　Bivariate analysis of the interaction between factor A and B

由表3可见，A2B2的淀粉提取率最高，与单独考虑因素A和B的结果一致。由于因素D的影响最小，可任取一水平，考虑到提取工艺的经济性和简便性以及对实际生产中设备的耐酸性要求，宜选择较高的pH，即取D3。最后得到试验范围内的最佳工艺条件为A2B2C3D3，即当加酶量为100 U/g，调节pH 4.8，在45℃下酶解6 h时，淀粉提取效果最佳。

根据正交优化试验确定的最佳提取工艺条件进行酶解辅助青稞粉提取淀粉验证试验，做3组试验取平均值，淀粉提取率为80.02%，与正交优化试验中A2B2C3D3组合（正交试验号15）的提取率79.52%接近，证明该优化工艺条件较为稳定，可以进行中试放大试验。

2.8超声中试放大试验的结果与分析

在正交优化试验基础上进行超声中试放大试验，中试放大试验的结果显示，青稞淀粉提取率为83.54%，淀粉提取率较正交试验的验证试验结果有所提高，其原因可能是超声有利于青稞细胞壁的破碎从而使淀粉更多的溶出，淀粉提取率上升。

3　结论

本试验采用纤维素酶辅助从青稞粉中提取淀粉，以淀粉提取率为评价指标，在单因素试验的基础上选择加酶量、酶解时间、酶解温度、pH 4个主要影响因素进行正交试验，得到纤维素酶辅助从青稞粉中提取淀粉的最佳工艺条件，并进一步进行超声中试放大试验，得出如下主要结论。

1）在试验范围内，各因素对淀粉提取率的影响次序是：C（加酶量）＞B（酶解温度）＞A×B＞A×C＞A（酶解时间）＞B×C＞D（pH），其中加酶量、酶解温度以及酶解时间与酶解温度的交互作用对提取率有显著影响。

2）在试验范围内，纤维素酶辅助从青稞粉中提取淀粉的最佳工艺条件为：当加酶量为100 U/g，调节pH 至4.8，在45℃下酶解6 h时，淀粉提取效果最佳，提取率为80.02%。

3）通过验证试验及超声中试放大试验可以认为试验确定的最佳提取工艺条件较为稳定，通过酶解辅助青稞粉提取淀粉的最终产率达80%左右，提取效果良好，可以为建立适应实际生产规模的酶解辅助青稞粉提取淀粉的工艺路线奠定基础。

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Study on Starch Extraction from Highland Barley Flours Assisted by Cellulase

ZHAO Yan-qiao，ZHU Zhi-yong，WANG Kai，LI Jian-ying*
（College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Starch was extracted from highland barley flours assisted by cellulose.In order to find the best conditions of enzymatic hydrolysis，with the starch extraction yield as the evaluation index，an orthogonal test was adopted to investigate added-amount of cellulase，enzymatic time，enzymatic temperature and pH value based on the results of single-factor tests.According to the best extraction conditions obtained，ultrasonic pilot enlarge experiment was carried out.The result of the orthogonal optimization test showed that added-amount of cellulase，enzymatic temperature，as well as the interaction between enzymatic time and enzymatic temperature have significant effects on the starch extraction yield.The best extraction conditions would be：added-amount of cellulase was 100 U/g，enzymatic temperature was 45℃，enzymatic time was 6 h and pH value was 4.8，under which the starch extraction yield from highland barley was 80.02%.The result of the ultrasonic pilot enlarge experiment indicates that the best extraction conditions obtained by the orthogonal optimization test were stable.

highland barley；starch；extraction；cellulase

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.022

天津市高校“优秀青年教师资助计划”；天津市高校科技发展基金项目（140023）；天津市教育科学“十二五”规划重点研究课题（HE3024）；天津市科学技术普及项目（13KPXM01SY008）

赵彦巧（1979—），女（汉），副教授，博士，研究方向：天然产物的提取与分离。
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李建颖（1961—），女（汉），教授，硕士，研究方向：天然化合物提取和生物化工。

2015-04-08