枸杞多糖的超声波辅助提取法及其抗氧化研究

杨新生，姜忠丽（沈阳师范大学，辽宁沈阳110034）

枸杞多糖的超声波辅助提取法及其抗氧化研究

杨新生，姜忠丽*
（沈阳师范大学，辽宁沈阳110034）

以枸杞为原料，考察超声波辅助提取中的料液比、时间、温度对枸杞多糖得率的影响，并采用响应面优化。枸杞多糖超声波辅助提取的最佳工艺条件：料液比为1∶20（g/mL），温度为70℃，提取时间20 min，理论枸杞多糖得率为3.37%，实际枸杞多糖得率为3.35%，近似率达到99.4%。枸杞多糖总抗氧化性达到10.44 U/mL，结果表明：枸杞多糖具有抗氧化作用。

枸杞多糖；超声波辅助提取；响应面优化；总抗氧化作用

枸杞一种茄科植物，已有研究证实枸杞多糖具有一定的抗衰老、抗肿瘤、降血脂、保肝和增强免疫力等生理功能［1］。枸杞总多糖是一些单糖或蛋白质、肽构成的复合多糖为主，还含有聚合糖同肽复合的多糖。复合多糖糖链是分枝结构，肽链上氨基酸含量占总的5%～30%。枸杞多糖的分子量较大，曾有人分离某4种枸杞多糖，其分子量大致在0.8×104Da～6.6×104Da间［2］。枸杞多糖的提取方法也有多种，最常用的是水提法［3-6］，黄文书、郝金玉等用微波法提取［7-8］，梁敏等［9］利用木瓜蛋白酶提取枸杞多糖，酶在一定条件下分解植物组织，加速糖提取，超声波辅助提取具有空化作用和次级效应，改变枸杞细胞壁和膜，提高枸杞多糖得率［10］。本试验采用超声波辅助提取枸杞多糖，并用响应面优化方法，采用苯酚-浓硫酸检测多糖，以期为枸杞多糖的利用提供理论参考。

1　材料与设备

1.1材料与试剂

枸杞：市售，产于宁夏中宁，均购自北京华联超市，样品颗粒饱满，色泽正常，原料采集后将其装入自封袋置于冰箱冷藏。

试验所用试剂均为分析纯；总抗氧化值测定试剂盒：购于南京建成生物研究所。

1.2仪器与设备

J014-2型电子分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；72光栅分光光度计：上海第三分析仪器厂；RE-52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生仪器厂；SB 25-12 DTDN型超声清洗仪：宁波新芝生物科技有限公司；SC-3610型离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；DGG-914OBD型电热恒温鼓风干燥器：上海森信实验仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1枸杞预处理

枸杞置于60℃真空干燥箱中，真空烘干后放入干燥器中24 h，取适量研碎后置圆底烧瓶中，加氯仿：甲醇（体积比为2∶1）20 mL/次，60℃下回流脱脂2次，每次2 h，滤出溶剂，残渣风干，残渣即为经过处理的枸杞。

1.3.2枸杞多糖的提取［11-12］

1.3.2.1枸杞多糖提取工艺流程

枸杞破碎烘干→提取→抽滤→浓缩→无水乙醇沉淀→二次沉淀→95%乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤→干燥→粗多糖

1.3.2.2枸杞多糖超声波辅助提取单因素试验

料液比、提取时间、提取温度作为考察因素，枸杞多糖得率为进行单因素试验的指标。

1）料液比对枸杞多糖得率的影响

称取等量已破碎烘干的枸杞，分别放入已编好号的锥形瓶中，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），60℃温度下提取20 min，脱脂棉过滤，重复提取2次，测定吸光值，由枸杞多糖得率来确定超声提取的料液比。

2）提取时间对枸杞多糖得率的影响

称取等量已破碎烘干的枸杞，分别放入已编好号的锥形瓶中，料液比定为1∶20（g/mL），60℃温度下超声提取5、10、20、30 min，提取2次，测定吸光值，由枸杞多糖得率来确定提取时间。

3）提取温度对枸杞多糖得率的影响

称取等量已破碎烘干的枸杞，分别放入已编好号的锥形瓶中，料液比定为1∶20（g/mL），分别在40、50、60、70℃温度下，提取2次，每次20 min，测定吸光值，由枸杞多糖得率来确定提取温度。

1.3.3多糖纯化［13］

先用10%三氯乙酸去除蛋白质沉淀，浓缩，在用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚进行多次洗涤，直至溶液颜色由黄色近无色。再于60℃干燥，得粗多糖，再将粗多糖热水溶解，脱脂棉过滤［14］，弃去沉淀，进一步重复上述洗涤过程直至颜色近为无色，干燥，得到枸杞多糖。

1.3.4多糖的检测：苯酚-浓硫酸［15］

标准曲线溶液的配制。准确称量50 mg干燥至恒重葡萄糖，加适量水溶解，转移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成浓度1 mg/mL的葡萄糖溶液。然后按着表1依次添加标准葡萄糖液、蒸馏水、5%苯酚溶液、浓硫酸，充分摇匀，沸水浴中30 min，冷却后于490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

表1　苯酚-硫酸法各溶剂添加量及浓度Table 1　The amount and concentration of each solvent of phenol sulfuric acid method

1.3.5枸杞多糖得率的计算公式

1.3.6总抗氧化性

按南京建成试剂盒说明书进行测定。配制好各试剂，按说明书加入各试剂，混匀，放置10 min，用蒸馏水调零，于1 cm光径下，测各管520 nm下吸光度。混匀，放置10 min，双蒸水调零1 cm半径，520 nm测各管吸光度总抗氧化性的定义，在37℃时，每分钟每毫升样品使反应体系吸光度（OD）值，每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。

其中：N为反应体系稀释倍数；n为样品测试前稀释倍数。

2　超声波辅助提取枸杞多糖的方法分析

2.1超声波辅助提取枸杞多糖单因素试验

2.1.1料液比对枸杞多糖得率的影响

料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），60℃温度下提取20 min，重复提取2次，料液比对枸杞多糖得率的影响如图1所示。

图1　料液比对枸杞多糖得率的影响Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由图1可以看出，一定料液比范围下，枸杞多糖得率随料液比增大而呈上升趋势，料液比为1∶20（g/mL），最高，再减小料液比，得率有所下降。因此，最优料液比条件应为1∶20（g/mL）。

2.1.2时间对枸杞多糖得率的影响

料液比定为1∶20（g/mL），60℃温度下超声波辅助提取5、10、20、30 min，提取2次，时间对枸杞多糖得率的影响如图2所示。

图2 时间对枸杞多糖得率的影响Fig.2　Effect of time on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由图2可以看出，枸杞多糖的得率随着时间的延长而上升，并在20 min时达到最大。此后，随时间延长得率反而下降，20 min为较好的时间，得率最高。

2.1.3提取温度对枸杞多糖得率的影响

料液比定为1∶20（g/mL），分别在40、50、60、70℃温度下，提取2次，每次20 min，提取温度对枸杞多糖得率的影响如图3所示。

图3　提取温度对枸杞多糖得率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由图3所示，随温度的升高，得率缓慢上升，60℃达到最高，此后，随温度的升高，略有下降，因此，60℃条件最适宜，得率最高。

2.2响应面法对枸杞多糖超声波提取工艺的优化

根据二次正交旋转组合试验的中心组合设计原理，综合上述试验结果，选取提取时间、料液比、提取温度的3个主要因素为自变量，采用三因素的响应面分析方法优化工艺。设计中心组合试验因素水平编码，如表2所示。根据表2，设计枸杞多糖得率响应面试验，并测定料液比、提取时间、提取温度等指标，试验结果见表3。

表2　中心组合试验因素水平编码表Table 2　Central composite test factors level encoding table

表3 枸杞多糖的得率响应面数据Table 3　Response surface data of the yield of lycium barbarum polysaccharide

续表3　枸杞多糖的得率响应面数据Continue table 3　Response surface data of the yield of lycium barbarum polysaccharide

计算得率指标回归方程的方差分析和提取各因素对得率显著性分析，见表4。

表4 得率回归方程方差分析Table 4　Variance analysis of regression equation

利用Design-Expert 8.0.6软件分析数据，建立关于得率的二阶响应模型，从而找到最优响应因子水平。得到响应值Y1（得率）和各因子（A、B、C）之间的回归拟合方程：Y1=3.29+0.325A-0.038B+0.080C-0.012AB+2.50×10-3AC-2.500×10-3BC-0.16A2-0.28B2-1.75×10-3C2。回归方程的相关系数R2=0.920 5，离回归标准差=0.818 2。从表4可以看出，回归模型中F=9，“Pr＞F”=0.004 2＜0.05，表明得到的回归方程拟合程度较好，回归效果显著，而失拟项P=0.776 1＞0.05，说明回归方程差异性不显著。因此，应用此方程来模拟指标值与因素的关系是可行的。

图4　料液比和时间对枸杞多糖得率影响的响应面立体分析图及其相应等高线图Fig.4　Effect of solid-liquid ratio and time on the yield of lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

图5　温度和时间对枸杞多糖得率影响的响应面立体分析图及其相应的等高线Fig.5　Effect of temperature and time on the yield of the lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

将提取提时间、料液比、提取温度3个参数分别固定，得率随剩余两个参数的变化趋势如图4～图6所示。

从图4中可看出，料液比和时间对容重的影响程度相近。从图5中可看出，温度的影响程度大于料液比，随着温度的增加，得率增加，随着时间的增加，得率先缓慢上升再下降。从图6中可以看出，随着温度增加，得率增加；随着料液比的升高，得率先缓慢升高再下降。

根据Design-Expert 8.0.6软件分析得到超声波辅助提取的最优条件如下：时间20.59 min，料液比为1∶20（g/mL），温度为70℃，得率3.37%。通过这最优条件，做验证试验，得到枸杞多糖得率为3.35%，与3.37%极为近似，因此，最终确定试验的最佳工艺条件为温度70℃，时间为20 min，料液比1∶20（g/mL）。

2.3枸杞多糖的总抗氧化性研究

枸杞多糖的总抗氧化能力见图7。

图6　温度和料液比对枸杞多糖得率影响的响应面立体分析图及其相应的等高线Fig.6　Effect of temperature and solid-liquid ratio on the yield of lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

图7 枸杞多糖的总抗氧化能力Fig.7　Total antioxidant capacity of lycium barbarum polysaccharide

根据图7可以看出枸杞多糖总抗氧化能力是随枸杞多糖浓度的增大而增强，当枸杞多糖浓度为2 mg/mL时，总抗氧化能力为10.44U/mL。从而，说明枸杞多糖抗氧化能力较强。

3　结论

1）超声提取枸杞多糖的最佳工艺条件：料液比1∶20（g/mL），提取温度为70℃，提取时间为20 min，枸杞多糖得率为3.35%。

2）枸杞多糖的总抗氧化能力测定，得到浓度为2 mg/mL时，枸杞多糖总抗氧化能力为10.44 U/mL。

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LBP Ultrasonic-assisted Extraction Method and Its Antioxidant Activity

YANG Xin-sheng，JIANG Zhong-li*
（Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China）

With lycium chinense as raw materials，studied the ultrasonic-assisted extraction of solid to liquid ratio，time，temperature effect on the yield of lycium barbarum polysaccharides，and the response surface optimization.The optimum technological conditions for ultrasonic-assisted extraction of lycium barbarum polysaccharides were that solid-quid ratio was 1∶20（g/mL），the temperature was 70℃，extraction time was 20 min. The theory of lycium barbarum polysaccharide was 3.37%，the actual yield of lycium barbarum polysaccharide was 3.35%，the approximate rate reached 99.4%.The total antioxidant activity of lycium barbarum polysaccharide reaches 10.44 U/mL，the results showed that，lycium barbarum polysaccharides had anti-oxidative effect.

lycium barbarum polysaccharides；ultrasonic-assisted extraction；response surface optimization；total oxidative effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.019

杨新生（1992—），女（汉），硕士研究生，研究方向：粮油深加工。
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姜忠丽（1968—），女（汉），副教授，研究方向：食品质量控制及食品营养。

2015-04-20