葡萄酵素天然发酵过程中抗氧化性能研究

郭艳萍，赵金安（太原工业学院环境与安全工程系，山西太原030008）

葡萄酵素天然发酵过程中抗氧化性能研究

郭艳萍，赵金安
（太原工业学院环境与安全工程系，山西太原030008）

采用分光光度法通过测定黑鸡心葡萄酵素天然发酵过程中不同阶段的总酚含量、还原能力及其对DPPH·、·OH、O2-·、ABTS自由基的清除率来评价天然酵素的抗氧化性能。结果显示：黑鸡心葡萄天然酵素在发酵过程中总酚含量上升，对DPPH自由基、O2-·、·OH和ABTS自由基清除能力均呈逐渐增加趋势，发酵前后分别提高了6.84%，19.82%、7.32%和14.81%增幅较大，同时显示出与酵素总酚含量的变化有明显的正相关性。

黑鸡心葡萄酵素；天然发酵；抗氧化性

葡萄酵素是以葡萄为原料，经过多种有益菌发酵制得的含有多种微生物次生代谢产物、维生素和矿物质的液态微生物发酵产品［1］。酵素参与人类生命活动的各种生理生化反应，是人体不可或缺的物质。研究表明，天然酵素具有抗氧化性能，可清除人体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤［2］。目前，国外研究人员已用生物技术提取天然酵素，将其加入到美容产品和保健食品中，就国内而言，天然酵素产品的应用范围还不是很广泛，随着人们保健意识的增强，消费观念的转变，酵素作为一种纯天然的、多功能的、安全性较高的食品、保健品和化妆品原料，具有很广阔的应用前景［3］。

黑鸡心葡萄是山西特有的葡萄品种之一［4］，色泽黑紫，形似鸡心，果粒密实，柔软多汁，但其含酸量较高果实生食口感较差，种植率下降，品种急需保护。本研究采用分光光度法对黑鸡心葡萄酵素天然发酵过程中的总酚含量、DPPH·、·OH、O2-·、ABTS自由基清除率和还原力进行了测定，为天然黑鸡心葡萄酵素的生产研发提供一定的数据支持，旨在为黑鸡心葡萄的多功能开发利用以及品种保护提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

山西清徐黑鸡心葡萄：取自山西清徐县徐沟镇果园；三氯乙酸、硫酸亚铁、水杨酸钠、硝基四氮唑蓝（NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、没食子酸、酚试剂、α，α-二苯基-β-苦苯肼（DPPH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾：均为分析纯。

1.2仪器与设备

SW-C1-IPD-Z型洁净工作台：上海安因科技有限公司；数显pH仪：美国Thermo赛默飞世尔科技；TGL-16G-C高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；752N型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1葡萄酵素的制备［5］

黑鸡心葡萄洗净、晾干，再与冰糖（紫外灭菌）按质量比1∶1加入到无菌玻璃瓶中，密封常温下发酵，以上步骤均在无菌操作台中进行。发酵开始后，每6天为一阶段取样，样品10 000 r/min冷冻高速离心15 min后进行各项测定。

1.3.2葡萄酵素pH的测定

发酵过程中每隔6天用pH计测定葡萄酵素的pH。

1.3.3总酚含量测定［6］

配置一系列浓度的没食子酸，加入显色剂后在765 nm下测定吸光度值，绘制标准曲线，y=0.092 0x+ 0.020 8，R2=0.999 9。取各阶段葡萄酵素样品100 μL加入45.9 mL去离子水，1 mL酚试剂，3 mL Na2CO3溶液（20 g/100 mL），25℃恒温水浴2 h后765 nm下测吸光度。

1.3.4DPPH·清除能力［6］

取不同阶段葡萄酵素样品40 μL加入到4 mL DPPH乙醇溶液中，再加入450 μL Tris-盐酸缓冲液（50 mmol/L，pH7.4），混匀避光，25℃恒温水浴1 h后517 nm下测吸光度A517。

式中：Ac为DPPH溶液与等体积无水乙醇混合时的吸光度值；Ai为样品本底管的吸光度值。

1.3.5超氧自由基（O2-·）清除能力

采用邻苯三酚法［7］：取不同阶段葡萄酵素样品50 μL加入到950 μL磷酸缓冲液（0.1 mol/L pH7.4），再加入1 mL 936 μmol/L NADH，1 mL 300 μmol/L NBT 和1 mL 120 μmol/L PMS。25℃反应5 min后560 nm下测吸光度A560。

式中：Ac为空白对照的吸光度值；Ai为样品本底管的吸光度值。

1.3.6羟基自由基（·OH）清除能力

采用水杨酸法［7］：取不同阶段葡萄酵素样品135 μL加入到1.4 mL 6 mmol/L H2O2，充分混匀后加入0.6 mL 20 mmol/L水杨酸钠和2 mL1.5 mmol/L FeSO4，25℃下恒温水浴1 h后562 nm下测定吸光度A562。

式中：Ac为空白对照的吸光度值；Ai为样品本底管的吸光度值。

1.3.7ABTS自由基清除能力［8］

ABTS母液：用pH7.4的5mmol/LPBS配制7mmol/L ABTS，加入过硫酸钾至浓度为2.45mmol/L，25℃下避光放置12 h。用PBS稀释母液在734 nm下吸光度为0.7。

取不同阶段葡萄酵素样品10 μL加入到5 mL ABTS母液中，30℃恒温水浴反应5 min后734 nm下测定吸光度A734。

式中：Ac为空白对照的吸光度值；Ai为样品本底管的吸光度值。

1.3.8还原力测定

采用普鲁士蓝法［7］。取不同阶段葡萄酵素样品30μL加入到2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）中，再加入1%K3［Fe（CN）6］2.5 mL，50℃恒温水浴半小时，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，6 000 r/min离心10 min，取2.5 mL的上清液，加入等体积去离子水和0.1%三氯化铁0.5 mL。700 nm下测定吸光度A700，吸光度值越高，还原力越强。

2　结果与分析

2.1葡萄酵素pH的变化

天然发酵过程中不同阶段黑鸡心葡萄酵素pH随时间的变化（图1）。

图1发酵过程中pH变化Fig.1　pH changes during fermentation

葡萄酵素在发酵初期pH从5.99降到4.55，之后在12 d稍有回升，到18 d再次降到3.08，之后趋于平稳。pH变化过程显示出葡萄酵素由于葡萄本身所含有的苹果酸、酒石酸、柠檬酸等酸性物质使初始pH为酸性。酵素在12 d至18 d内快速发酵，发酵过程中产生的二氧化碳溶解在酵液中，也使得pH降低。随着发酵进行进入缓慢发酵阶段，酵液中微生物对葡萄蛋白的降解利用，使得pH稍有回升呈波形起伏。

2.2葡萄酵素总酚含量的测定

按照1.3.3总酚含量的测定方法，测得黑鸡心葡萄酵素总酚含量在发酵过程中各阶段的变化见图2。

图2 发酵过程中总酚含量变化Fig.2　Total phenolic changes during fermentation

图2显示，葡萄酵素总酚含量在发酵过程中逐步上升，至30 d达到最大值2.852 mg/mL后下降并趋于稳定，但总酚含量仍高于发酵初始时含量。发酵在最初的30 d内逐步增加，之后趋于稳定。酵素发酵初期酵母等微生物快速繁殖，此时酚类物质伴随着碳源氮源的消耗而释放出来，使得总酚含量增加。随着发酵进行，酚类物质已基本溶出，溶出速率趋于平稳。

2.3葡萄酵素对DPPH·清除能力

有研究表明多酚类物质及其代谢产物的抗氧化活性与其结构中的核心功能组有关，并且这类特殊的核心功能组结构可清除自由基、螯合金属离子及氧化活性物质。DPPH·是人工合成的脂溶性自由基，广泛用于测定物质的抗氧化性，更广泛的应用于测定葡萄及葡萄酒的抗氧化性［9］。葡萄酵素发酵各阶段DPPH·的清除作用如图3所示。

图3 发酵过程中DPPH·清除能力变化Fig.3　DPPH·scavenging ability changes during fermentation

由图3可看出，葡萄酵素对DPPH·有较高的清除能力，发酵前后清除率增加6.84%，第30天出现最大值94.87%，发酵后期略有下降。结合图2来看，葡萄酵素对自由基的清除能力变化与总酚含量变化曲线相似，均在发酵初期第6天有小幅升高，在18天小幅回落，在30天出现峰值后下降。有研究表明，酚类物质具有较强的抗氧化活性。葡萄酵素发酵过程中逐步释放出酚类物质，酚类物质的积累使得酵素的抗氧化活性增强。

2.4葡萄酵素对超氧自由基（O2-·）清除能力

O2-·是人体内活性氧的一种，可作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基引起蛋白质、核酸和脂类的氧化损伤。葡萄酵素发酵各阶段对O2-·的清除作用见图4。

图4　发酵过程中O2-·清除能力变化Fig.4　O2-·scavenging ability changes during fermentation

图4显示，葡萄酵素发酵过程中对O2-·清除能力的增幅最大，发酵前6 d清除率急剧增大，6 d～12 d略有降低，12 d～24 d持续增高，到30天达到最大值，发酵前后清除率增加了19.82%。

2.5葡萄酵素对羟基自由基（·OH）清除能力

·OH是生物体产生的一种反应活性极高的自由基，具有极强的得电子能力也就是氧化能力，可损伤细胞膜，导致疾病发生。葡萄酵素发酵各阶段对·OH的清除作用见图5。

图5发酵过程中·OH清除能力变化Fig.5·OH scavenging ability changes during fermentation

图5显示，葡萄酵素对·OH的清除能力相对于其它自由基的清除能力较低，但高于其它天然酵素［2］对·OH的清除能力。葡萄酵素对·OH的清除能力在第6天出现小幅增强后迅速降低，18 d降至最低值后急速上升，在30 d时达到54.84%，比未发酵时增加了7.32%。

2.6葡萄酵素对ABTS自由基清除能力

葡萄酵素发酵各阶段对ABTS自由基的清除作用如图6所示。

图6　发酵过程中ABTS自由基清除能力变化Fig.6　ABTS radical scavenging ability changes during fermentation

由图6可知，发酵过程中葡萄酵素对ABTS自由基的清除作用较强，除12天有小幅降低外清除能力持续增高，30天时出现最大值88.89%，发酵前后清除率增加14%左右。ABTS自由基的清除能力常被用来衡量葡萄及葡萄制品的抗氧化性，黑鸡心葡萄酵素对其清除能力较高说明抗氧化性较好，有一定的开发及应用价值。

2.7葡萄酵素发酵过程中还原力的变化

葡萄酵素发酵各阶段还原力的变化如图7所示。

图7　发酵过程中还原力变化Fig.7　Reducing power changes during fermentation

由图7可知，葡萄酵素发酵过程各阶段还原力呈波浪形不规则变化，大幅上升后大幅回落，发酵后期又大幅上升无规律可寻。

3　结论

研究结果表明在天然条件下，以山西特有葡萄品种黑鸡心为原料，经过多种有益菌发酵制得的黑鸡心葡萄酵素有较好的抗氧化的能力，并且经发酵30 d产生的酵素抗氧化能力最强。抗氧化性能从自由基清除率和还原力两方面考查，得出以下结论：发酵过程中葡萄酵素对DPPH自由基、O2-·、·OH和ABTS自由基清除能力均呈逐渐增加趋势，发酵前后分别提高了6.84%，19.82%、7.32%和14.81%，增幅较大。还原力呈波浪形不规则变化，呈上升趋势，抗氧化能力间歇性增强。对葡萄酵素发酵各阶段总酚含量的测定结果表明，葡萄酵素在发酵过程中总酚含量上升，酵素对自由基的清除能力与总酚含量的变化呈相同趋势，具有一定相关性。本研究结果可为天然黑鸡心葡萄酵素的生产研发提供一定的数据支持，为黑鸡心葡萄的多功能开发利用以及品种保护提供理论依据。

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［2］蒋增良，毛建卫，黄俊，等.蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化性能的变化［J］.食品工业科技，2013（2）：194-201

［3］王定昌，赖荣婷.糙米酵素的功能与开发［J］.粮油食品科技，2001，9 （1）：2-3

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Changes in Antioxidant Activity of Black Heart Grapes-ferment during Natural Fermentation Process

GUO Yan-ping，ZHAO Jin-an
（Department of Environmental and Safety Engineering，Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，Shanxi，China）

To investigate the antioxidant ability of black heart grapes-ferment，the content of total phenol，DPPH·，·OH，O2-·，ABTS radical scavenging ability during fermentation process were determined by spectrophotometer.The results indicated that the amount of total phenolics were increased during fermentation process.Before and after fermentation the DPPH·、·OH、O2-·、ABTS radical scavenging ability were increased by 6.84%，19.82%，7.32%and 14.81%，showed a high antioxidant capacity.The change of antioxidant activity was relevant to the change of total phenolics.

black heart grapes-ferment；natural fermentation；antioxidant ability

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.009

太原工业学院青年科学基金资助项目（2013LQ01）；山西省高等学校大学生创新创业训练项目（2013375）

郭艳萍（1984—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：植物蛋白质工程。

2015-04-28